CFTCR离子通道在牙釉质的矿化过程中的重要性研究
[摘 要]目的:观察囊性纤维跨膜转导调控因子(CFTCR)在小鼠不同组织中的表达及定位。方法:采用RT-PCR的方法,设计两对引物,位于核苷酸第1 348~1 708之间,另一对引物为β-actine,用来检测RNA是否完整。然后用抗CFTCR抗体,应用免疫组化方法检测其在牙胚组织中的定位。结果:CFTCR在小鼠的14种组织中有表达,包括牙胚组织和骨组织。并且CFTCR在牙成釉细胞中高表达。结论:本研究首次发现CFTCR在矿化的组织中包括牙齿的成釉细胞中高表达,提示CFTCR这种离子通道可能在牙釉质的矿化过程中起着重要的作用。
[关键词]小鼠; CFTCR;牙釉质;矿化；重要性
囊性纤维化病变(Cystic fibrosis, CF)是一种致命的染色体隐性遗传性疾病,由于CF跨膜转导调控因子( fibrosis transmembrane con-ductance regulator,CFTCR)的基因突变所致。CFTCR基因的突变会导致蛋白组装过程的缺陷以及这种离子通道功能的改变。其临床症状包括:胰腺的缺陷,胆管堵塞,男性缺精症,高汗腺Cl-含量,小肠梗塞,鼻息肉的形成,慢性肺纤维化,慢性窦黏膜脱水等。CFTCR基因编码一个含有1 480个氨基酸残基的蛋白,CFTCR是一种位于上皮细胞膜上的cAMP依赖性Cl-通道(图1)[1]。1990年其基因的克隆为进一步了解CF 细胞的生物学和病理学特征奠定了基础。只有了解疾病的发生发展机制才能采取有效的预防和治疗措施。研究CFTCR的作用机制,需有好的动物模型,使疾病发生的全过程可以清晰地再现。去CFTCR基因小鼠被用来研究人类CF疾病,也可为我们研究牙釉质的发育提供一个极好的模型。CFTCR在釉质发育中的作用还不了解,但是通过对去CFTCR基因小鼠牙釉质的观察,我们推测CFTCR在牙釉质的发育过程中起着重要的作用。本研究目的在于观察CFTCR在小鼠不同组织,尤其是矿化组织中的表达,进而证实CFTCR在牙齿中的定位。
1 材料和方法
1.1 动物与组织取材采用出生后0、1、3、5、10 d C57BL6小鼠(美国NIH动物中心提供),CFTCR去基因鼠(Dr.Bablar惠赠)。解剖显微镜下分离出14种组织:皮肤、大脑、眼球、舌、颅骨、肺、胸腺、下颌骨、胃、长骨、肝脏、肾脏、牙(胚)、小肠,立刻投入液氮中。作免疫组化的小鼠组织,液氮中放置过夜后进行冰冻切片,厚度为5μm,-80℃保存。
1.2 反转录PCR(RT-PCR)组织总RNA的提取采用Qiagen Mini试剂盒(Qiagen公司),提取过程中使用的所有器械、试剂、器皿、手套、操作台以及通风橱全部无RNA酶的污染。小鼠CFTCR下游引物为: 5′-GGATTGGGAATTACTGGAG,上游引物为3′-CTGCTGGAGTTG GAAGCTTT。退火温度为55℃。PCR产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳证实大小,紫外灯下照相。PCR产物经纯化后测序。用β-actine证实RNA的完整性。阴性对照:无RNA酶污染的水;阳性对照:小鼠小肠组织。
1.3 免疫组化研究冰冻切片从-80℃中取出后,室温干燥。冷丙酮中固定10 min;过氧化氢液孵育10 min以去除内源性过氧化物酶,漂洗后滴加一抗(SantacruzBiotech公司),-4℃孵育过夜。第2天,滴加二抗孵育30 min,用AB酶制剂孵育30 min,滴加辣根酶底物30 s,冲洗。复染、封片。
2 结果
2.1 RT-PCRβ-actine证实14种组织的RNA均完整无污染(图2),在14种组织中均检测到CFTCR的表达,其大小为360 bp(图2)。纯化产物测序结果证实为CFTCR基因。图1 CFTCR是cAMP依赖性Cl-通道图2 10 g/L琼脂糖凝胶电泳,14种组织中均检测到CFTCR的表达,β-actine证实14种组织的RNA均完整无污染。
2.2 免疫组织化学
2.2.1 正常小鼠牙胚组织在出生后0 d,未极化的成釉细胞中未检测到CFTCR阳性染色;出生后第3天,成釉细胞开始极化,在成釉细胞的分泌端可见阳性染色(图3,见彩色插页);出生后第5天,更多的阳性染色颗粒集中于分泌侧(图4,见彩色插页);出生后第10天,阳性染色消失。正常小鼠小肠组织:出生后0、3、5、10 d在整个小肠绒膜上皮中均有阳性染色(图5,见彩色插页)。
2.2.2 CF小鼠组织无论是牙胚组织(图6,见彩色插页)还是小肠组织(图7,见彩色插页)均未检测到阳性染色。
[NextPage]3 讨论
有研究显示,CFTCR基因在特异性的组织中高表达。这些组织包括:小肠隐窝、肾脏[3]、结肠黏膜[4]、呼吸道黏膜[5]、黏膜下腺[6]。而在回肠、十二指肠中低表达[7]。Trezise[8]则证实CFTCR的mRNA能够在胰腺导管上皮、小肠黏膜上皮、空肠、肺上皮、精索上皮等特异性上皮中高表达。本实验显示,CFTCR基因在皮肤、大脑、眼球、舌、颅骨、肺、胸腺、下颌骨、胃、长骨、肝脏、肾脏、牙(胚)、小肠有表达。CFTCR基因的突变,可以导致多脏器多种疾病的发生,是目前国际上关注的热门课题之一。作为一种染色体隐性遗传性疾病,由于依赖于cAMP的Cl-通道失活,引起呼吸道、胰腺、生殖系统和消化系统的损害[9]。在矿化组织中CFTCR的表达未见报道。然而,我们以前的研究显示,CF小鼠的牙釉质与正常小鼠的牙釉质有明显的不同[10]:前者呈白垩色,后者呈健康的黄褐色(图8,见彩色插页)。进一步的研究显示,正常小鼠釉质矿化为80.9%,而CF小鼠釉质矿化仅为51.5%,且釉晶体排列不规则,表现出明显的釉质矿化不全现象[11]。这些现象说明CFTCR与牙釉质的矿化有某些直接或间接的联系。本实验观察到CFTCR不仅在软组织中,如大脑、肺、等有表达,在长骨、下颌骨、牙胚等矿化组织中也有表达。说明CFTCR在矿化组织的发育过程中起着重要作用。由于CFTCR具有调控许多膜表面上离子通道的作用,尤其可以调控细胞内外的pH值,所以CF小鼠中釉质发育异常也可能与此有关。虽然CFTCR在牙胚中有表达,但仍须进一步了解它是定位于成牙本质细胞、成釉细胞上,还是定位于整个牙胚中。成釉细胞是来源于外胚层的极化的上皮细胞。当成釉细胞极化时,CFTCR蛋白集中于根尖侧区域,但在非极化状态
下,CFTCR蛋白检测不到。这一发现与Gaillard等的研究一致,他们认为CFTCR蛋白定位于小肠上皮细胞的分泌端[12]。CFTCR不仅是一种cAMP、cGMP活性的膜Cl-通道蛋白,还具有调控其他膜通道和细胞的功能,例如在汗腺中可以调节盐和水的分泌。目前发现CFTCR可以调控EnaC(上皮Na+通道)[13]、CACC(Ca2+活性Cl-通道)[14]、ROMK(肾K+通道)[15]和NBC(Na+:HCO3-通道)[16]。这些通道都与矿化组织的发育有关。可以肯定牙成釉细胞中有CFTCR基因的存在,基因产物定位于成釉细胞的分泌端,面向牙釉质,利于离子的转运,直接、间接调控釉晶体的生长和矿化。CFTCR是如何控制成釉细胞膜上离子的转运,有哪些离子参与了这一过程,他们是如何相互作用而导致釉质发育的异常,有待继续研究。
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