口腔细菌生物膜形成方法、特性及应用

[摘　要]许多研究证实生物膜中的细菌对抗菌剂的敏感性比其处于浮游状态时要低得多,而口腔细菌却常以生物膜方式致病,对许多抗菌剂具有很强的抵抗力,这就造成实验室的药敏结果用于临床效果不佳。因此详细了解处于生物膜状态的口腔细菌对抗菌剂的敏感性,对于临床上治疗和预防许多口腔疾病具有重要意义。

[关键词]口腔细菌;生物膜;抗菌剂;敏感性

　　
口腔两大常见疾病—龋病和牙周病均和牙菌斑有密切的关系。牙菌斑是一种典型的生物膜,控制牙菌斑的一个主要手段是使用抗菌剂。但是我们有时会发现在临床治疗过程中使用抗菌剂并没有达到预期目的,研究表明,其中一个重要的原因就是我们在实验室测定细菌对抗菌剂敏感性时,用的是浮游状态的细菌,而不是生物膜。现在已有许多研究证实生物膜中的细菌对抗菌剂的敏感性比其处于浮游状态时要低得多,而口腔细菌却常以生物膜方式致病,对许多抗菌剂具有很强的抵抗力,这就造成实验室的药敏结果用于临床效果不佳。因此详细了解处于生物膜状态的口腔细菌对抗菌剂的敏感性,对于临床上治疗和预防许多口腔疾病具有重要意义。虽然目前生物膜的研究还受许多条件如生物膜形成条件的控制、检测手段局限等因素限制,难度较大,但还是有许多相关研究陆续发表,本文就近年来口腔细菌生物膜对抗菌剂敏感性研究进展作一简要综述。

1　口腔细菌生物膜形成方法

口腔细菌生物膜的研究模型报道虽然很多,但归纳起来不外乎两大方面,一种是在体外形成生物膜,方法多样,较易进行,但和口腔内的实际情况有一定差别,目前口腔细菌生物膜对抗菌剂的敏感性较集中于体外研究;另一种则是在人口腔内形成生物膜,这种方法影响因素多,不易控制,但较接近口腔内的实际情况。因此本文按研究报道中生物膜形成方法分为体外形成生物膜和人口腔内形成生物膜两大类,并分别归纳叙述口腔细菌生物膜对抗菌剂敏感性。

1.1　体外形成的口腔细菌生物膜
Wright等用羟基磷灰石块悬吊于装有培养基的烧瓶中培养细菌的方法形成牙龈卟啉菌(por-phyromonasgingivalis,Pg)生物膜,将已培养3 d的Pg生物膜和不同浓度的甲硝唑作用后,再培养5 d,用电镜观察生物膜,结果发现用20μg/mL浓度甲硝唑作用后Pg生物膜仍能生长,而这个浓度已相当于甲硝唑作用于浮游状态Pg的最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration, MIC)的160倍。此研究结果显示生物膜中的Pg可能对甲硝唑全身用药所能达到的药物浓度仍具有耐受力[1]。用体外形成的伴放线放线杆菌(http://www.51lunwen.com/kouqiang/actinobacillusactinomycetemcomitans, Aa)生物膜比较几种漱口水的抗菌活性。其中所有3种漱口水对浮游状态的Aa杀灭均达到99.99%。而对生物膜中的Aa,只有一种含矿物油的漱口水LA,细菌减少达98.20%,具有显著统计学意义,而另两种漱口水,一种含有氟化钠和氟化亚锡,另一种则含有玉洁纯,均无统计学意义[2]。粪肠球菌(enterococcus faecalis)在难治性根尖周炎中常能检测到,用硝酸纤维膜在体外形成生物膜,分别测试对不同抗菌剂的敏感性,结果发现只有洗必泰对形成1 d和3 d的生物膜中的粪肠球菌数减少最多。同时作者指出形成1 d的生物膜用于抗菌活性试验较有效;而形成3 d的生物膜因脱落的细胞较多,虽不太适宜用于药敏试验,但因为形成3 d的生物膜更成熟,所以更难以去除。建议临床上用洗必泰治疗难治性根尖周炎可能会有帮助[3]。在体外形成生物膜方法中,有一种称作生物膜厚度恒定发酵装置(constant depth film fermentor,CDFF)的方法用得较多。Wilson等用CDFF形成的血链球菌生物膜和浮游状态血链球菌,分别暴露于洗必泰和氯化十六烷基铵基吡啶(cetylpyridi-nium chloride),用CFU计数的方法计算未被杀灭的活菌数。结果发现生物膜中的血链球菌对上述两种抗菌剂的敏感性比处于浮游状态的血链球菌更低,并且形成7 d的生物膜(older biofilm)和形成4 d的生物膜(younger biofilm)对抗菌剂的敏感性相似。因此作者提出MIC不能作为抗菌剂对血链球菌生物膜有效作用的一种可靠预估数据[4]。对于由多种口腔细菌一起形成的生物膜对抗菌剂的敏感性研究也有报道。Kinniment等用CDFF方法形成含9种口腔细菌的生物膜,分别和浓度为0.125 mL/L和1.25 mL/L的洗必泰作用,给药模式为每间隔12 h药物作用一次,每次持续10 min,共作用8次,最后计算其活菌数。结果显示0.125 mL/L洗必泰对生物膜中细菌几乎没有什么影响,而1.25 mL/L洗必泰则对生物膜中各种细菌具有不同的抑制作用[5]。而Pratten等用CDFF方法形成含6种口腔细菌的生物膜,用2 mL/L洗必泰分别作用1,5,60 min,用扫描电镜观察。结果发现用2 mL/L洗必泰作用1,5 min时对生物膜中的细菌几乎没有影响,而作用60min时则有显著杀菌作用[6]。

1.2　人口腔内形成的生物膜
Netuschil等用自愿者牙面上自然形成3 d的牙菌斑生物膜,用1 mL/L洗必泰漱口后,从牙面上刮取牙菌斑,用fluoresceindiacetate (FDA)和ethidium bromide (EB)进行染色,在荧光显微镜下观察死菌或活菌数。结果发现用洗必泰作用后1h的生物膜中活菌百分比降至19%到34%,但到6h和8 h后,活菌百分比又恢复到初始水平。Zaura-Arite等将牙本质块戴在自愿者牙面上形成牙菌斑生物膜,分别在6,24,48 h后取下,用2 mL/L洗必泰作用1 min,然后进行荧光染色,最后用激光共聚焦扫描显微镜(confocal scanninglaser microscopy, CSLM)进行观察,每个标本分3层扫描,计算活菌百分比。发现2 mL/L洗必泰对6 h的牙菌斑有明显杀灭效果,而在48 h牙菌斑的最外一层则显出生物膜对洗必泰抵抗力的本质[7]。

2　生物膜特性和可能耐药机制

随着研究的深入,对生物膜的认识已不仅仅局限于生物膜是个致密细胞团块,现在许多研究认为生物膜是一个有着三维立体空间结构的生态系,其中有丰富的管道系统进行营养和代谢产物的输送,并且还充满着复杂的信号分子,以满足细胞之间的信息交流,协调各个细胞的行为,并且表达出一些生物膜细胞所特有的功能。如:生物膜对宿主防御具有较强的抵抗力,耐受干燥,对抗菌剂敏感性降低,具 本

有空间和环境的多样性,能表达不同于浮游状态细菌的表型,抵抗流水的冲刷等特点,其中生物膜对抗菌剂较高耐受性这一特性具有重要的临床意义[8,9]。生物膜对抗菌剂耐药可能和以下原因有关:①生物膜结构的影响[10]。②基质对抗菌剂渗入生物膜的作用,生物膜中大量的细胞外基质可以起到分子筛样的作用以阻挡抗菌剂的进入[11]。③由于生物膜内部的营养和氧浓度相对较低,且细胞密度高,所以生物膜内的细菌生长缓慢,常处于静止期,对抗菌剂的敏感性相对降低[12]。④一些微环境因子(micro-environmental factors)对抗菌剂的影响,如β内酰胺酶(β-lactamase)在局部形成较高浓度,对抗菌剂产生影响。⑤生物膜基因表达的改变,已有证据表明,生物膜中细胞会表达出一些与浮游细胞不同的表型,而这些特殊表型的表达很可能就是生物膜对抗菌剂耐受的重要原因[13]。

[NextPage]3　评价

尽管生物膜对抗菌剂的研究越来越多,但要将不同的研究做对比、分析、评价尚存在一定困难,原因有以下几点:首先生物膜的形成,不同的研究者采用不同的方法。其中生物膜黏附材料选择,有玻片、硝酸纤维膜、羟基磷灰石片、牙本质块和自然牙面等;培养环境不同,有一般培养箱、人工口腔、恒化器和人口腔等;培养方式不同,有间断培养和连续培养。其次,所选药物本身的特性不同,药物浓度选择、药物作用时间和方式存在差异。第三、观察生物膜对抗菌剂敏感性的方法不同。介绍几种常见的研究方法:①将药物作用后的生物膜震荡,脱落的生物膜细胞接种到琼脂营养平板培养,CFU计数,计算死菌或活菌比。其优点是方法简单,对设备要求低;缺点是操作繁琐,破坏了生物膜,不能观察到生物膜结构变化。②扫描电镜观察。优点 是操作较简单,能直接观测生物膜中细胞情况;缺点是电镜观察需要对生物膜标本进行脱水、固定、包埋、染色等处理,这样会对生物膜结构和其中各成分间相互关系造成变动,观察到的结果就会和实际情况不符。③近几年将激光共聚焦扫描显微镜(confocal scanning laser microscopy,CSLM)逐渐用于生物膜结构观察,虽然其放大倍数低于电镜,但却可以克服电镜的上述缺点。一般只要将生物膜进行荧光染色,就可以直接在CSLM下观察,可以做到原位、实时、动态观察生物膜结构。另外,因为扫描时每层的厚度可以非常薄,所以图像经软件处理后,可以得到生物膜的三维信息[14]。由于存在上述原因,所以在评价、比较不同研究时有相当难度。但综合目前的研究结果,大致可以得到以下一些概念:①口腔中大部分细菌以生物膜形式存在时,对抗菌剂的敏感性比浮游状态时大大降低,甚至可达上百倍。②生物膜的形成时间及其成熟度对抗菌剂的敏感性有一定影响。一般形成时间较长、较老的生物膜对抗菌剂的敏感性比形成时间较短、年轻的生物膜低。③许多作者在讨论中均指出,目前对浮游状态细菌的MIC和MBC(minimum bactericidal concentration)对生物膜的药敏测定并不适用,应该尽快建立一种标准的实验室方法,能测定生物膜相应BIC (biofilm inhibitoryconcentration)和BKC (biofilm killing concentra-tion),用来评价生物膜对抗菌剂的敏感性,并指导临床用药[15]。

参考文献
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[3] Lima KC, Fava LR, Siqueira Jr.Susceptibilities of enterococcusfaecalis biofilms to some antimicrobial medications[J].J En-dodon, 2001, 27(10):616
[4] Wilson M, Patel H, Fletcher J.Susceptibility of biofilms ofStreptococcus sanguisto chlorhexidine gluconate and cetylpyri-dinium chloride[J].Oral Microbiol Immunol, 1996, 11:188
[5] Kinniment SL, Wimpenny JWT, Adams D,et al.The effect ofchlorhexidine on  mixed culture oral biofilms grown in anovel model system[J].JAppl Bacterio, 1996, 81:120
[6] Pratten J, Barnett P, Wilson M.Composition and susceptibilityto chlorhexidine of multispecies biofilms of oral bacteria[J].Appl Enviro Micro, 1998, 64(9):3515
[7] Zaura-Arite E, Marle JV, Cate JM. Confocal microscopystudy of undisturbed and chlorhexidine-treated dental biofilm[J].JDent Res, 2001, 80(5):1436
[8] Costerton JW, Lewandowski Z. Microbial biofilms[J].AnnuRev Microbiol, 1995, 49:711
[9] Kolenbrander PE.Oral microbial communities: biofilms, interactions,and genetic systems[J].Annu Rev Microbiol, 2000, 54:413
[10] Stewart PS, Rayner J, Roe F,et al.Biofilm penetration anddisinfection efficacy of alkaline hypoch