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生长因子对人髁突软骨细胞Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型前胶原基因表达的调控研究

2007-01-23

　　摘　要：目的:研究低血清培养条件下转化生长因子-β（TGF-β)、胰岛素样生长因子-Ⅰ(IGF-Ⅰ)、碱性成纤维生长因子（bFGF)对人髁突软骨细胞Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型前胶原基因表达的调控作用。方法:采用体外细胞培养及mRNA狭缝杂交的方法。结果:IGF-Ⅰ对3种前胶原的mRNA水平无显著影响。bFGF、TGF-β均呈不同程度地抑制Ⅱ型胶原的基因表达,分别为对照组的0.352及0.658倍，同时TGF-β显著增加了Ⅰ型胶原的基因表达。结论:IGF-Ⅰ具有稳定软骨细胞表型的作用，bFGF、TGF-β可抑制软骨细胞终末分化。


　　胶原蛋白是关节软骨重要的细胞外基质成分，占软骨干重的60%～80％。胶原纤


维相互交联形成网状支架，从而赋于软骨特有的组织形态。胶原的种类、含量及其空间排列方式，决定着关节软骨的生物力学特性和功能状态。骨关节病（osteoarthrosis，OA）及关节损伤早期，关节软骨都表现为增殖旺盛，但最终以软骨进行性破坏、骨赘形成或为纤维结缔组织所取代。最近的研究表明，在病变关节软骨中出现了除软骨特异性的Ⅱ型胶原以外的Ⅰ、Ⅲ型的胶原［1,2］。因而有学者提出病变软骨细胞的表型基因异常是软骨损伤及OA修复失败的直接原因，并指出调控软骨细胞表型在OA及关节软骨损伤治疗中的可行性［3］。本研究旨在探讨转化生长因子-β（TGF-β)、胰岛素样生长因子-Ⅰ(IGF-Ⅰ)、碱性成纤维生长因子（bFGF)对几种重要的间质型胶原即Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型胶原表达的调控作用,以期为骨关节病及软骨损伤的异常修复发生机理及筛选并合理应用生长因子治疗OA及关节损伤的可行性提供理论基础和实验依据。


　　1　材料和方法


　　1.1　材料


　　bFGF、 TGF-β、 IGF-Ⅰ、 DMEM培养基（GIBCO BRL，USA）,含Ⅰ、Ⅱ型胶原cDNA片段质粒,含Ⅲ型胶原及β-Actin cDNA片段的质粒,细胞总RNA分离纯化试剂盒及低熔点琼脂糖（Gene Co Ltd．USA）,限制性内切酶EcoR I，Hind Ⅲ（Gibco USA）,地高辛标记检测试剂盒及尼龙膜（Boehringer Mannheim,Germany），其余试剂均为进口分装或国产分析纯。


　　1.2　方法


　　1.2.1　Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型胶原cDNA探针的提取、标记 各型重组质粒经转化、鉴定后，大量扩增，经碱裂解法抽提质粒，限制性酶切消化后低熔点琼脂糖凝胶电泳回收特定cDNA片段。探针标记按地高辛标记试剂盒说明进行。


　　1.2.2　人髁突软骨细胞培养及实验分组 取培养第二代人髁突软骨细胞，以1×105/ml密度接种于125 ml培养瓶。DMEM培养基中加入20％的小牛血清。于37℃、5％ CO2浓度、饱和湿度下培养，隔日换液，待细胞长满汇合成单层时（约为2×106）。更换培养基（含0.4%小牛血清），分别加入不同的实验因素。实验分组如下：空白对照组，TGF-β（5 ng／ml）组，IGF-Ⅰ（10 ng／ml）组，bFGF（50 ng／ml）组。每5瓶细胞为一组，继续培养24 h。终止培养，提取各样品的总RNA。


　　1.2.3　人髁突软骨细胞RNA的提取、鉴定 采用RNeasy试剂盒提取细胞总RNA。紫外分光光度计测定OD260OD280值，以确定RNA的纯度和含量，大于1.8表明纯度较好。经甲醛变性凝胶电泳鉴定，28 S及18 S条带清晰，所获RNA具较好完整性。


　　1.2.4　狭缝杂交及密度扫描 取适当大小的尼龙膜，取各RNA样本，依次等倍稀释，即4、2、1 μg，上样抽滤。置120℃真空烤箱内30 min,使样品RNA与尼龙膜发生交联。将点样的尼龙膜放入塑料袋中，加入预杂交液(7％SDS，50 mmol/L磷酸钠pH7.0，50％甲酰胺，2％封闭剂，5×SSC，0.1％月桂酰肌氨酸钠，50 μg／ml酵母总RNA）4 ml，50℃水浴保温2 h。更换杂交液（含50 pg/ml已变性的特定cDNA探针），50℃恒温杂交过夜。杂交后，以2×SSC，0.1%SDS；0.1×SSC，0.1％ SDS依次洗膜。在抗地高辛抗体（150 mu／ml）溶液中孵育30 min，将杂交膜转移至3 ml显色液中，暗室内室温孵育16 h。马来酸缓冲液中终止反应。待尼龙膜干燥后，进行灰度扫描，自动记录结果。

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　　1.2.5 统计方法 上述实验结果均以±s表示，经t检验确定组间差异的统计学意义。


　　2　结 果


　　2.1　各种处理因素对人髁突软骨细胞前胶原proα1（Ⅱ）mRNA水平的影响


　　在含0.4％ NCS的DMEM培养基中加入IGF-Ⅰ、 bFGF、TGF-β1后24 h，软骨细胞proα1（Ⅱ）的mRNA水平出现不同变化，bFGF显著抑制proα2（Ⅱ）的表达，为对照组的0. 352倍，TGF-β及IGF-Ⅰ对proα1（Ⅱ）表达无显著影响(表1、2)。


　　2.2 各种处理因素作用对关节软骨细胞前胶原proα1（Ⅰ），proα1（Ⅲ）mRNA水平的影响


　　生长因子作用24 h，软骨细胞proα1（Ⅰ）mRNA水平在TGF-β1及IGF-Ⅰ作用下都有不同程度的升高,其中TGF-β1较为显著。为对照组的1.228倍，IGF-Ⅰ，bFGF与对照相比为1.164及0.840倍。3种生长因子对proα1（Ⅲ）均无显著作用(表1、2)。


表1 生长因子对人髁突软骨细胞Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型前胶原mRNA表达的影响






























　分组 mRNA密度值(±s×103)
proα1(Ⅰ) proα1(Ⅱ) proα1(Ⅲ)
对照组 8．29±0．66 5．13±0．53 4．75±0．98
TGF-β 10．18±0．84* 3．51±0．20* 3．56±0．53
IGF-Ⅰ 9.56±0.12* 5.89±0.22 5.21±1.03
bFGF 7.77±0.14 1.81±0.22** 4.06±0.04

与对照组比较 * P＜0.05 *　* P＜0.01


　　2.3　几种因素作用下前胶原Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型mRNA相对值的变化


　　bFGF作用下,α1（Ⅰ）／α1（Ⅱ）显著升高，为4.293;TGF-β1能提高α1（Ⅰ）／α1（Ⅲ）值，为2.859(表2)。


表2 生长因子对关节软骨Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型前胶原mRNA相对水平变化











































分组 前胶原mRNA
实验组／对照组 相对值
α1（Ⅰ） α1（Ⅰ） α1（Ⅰ） α（Ⅰ）／α（Ⅱ） α（Ⅰ）／α(Ⅲ）
对照组 1 1 1 1.616 1.746
TGF-β1 1. 228 0. 685 0.745 2.900 2.859
IGF-Ⅰ 1.164 1.148 1.084 1.628 1.835
bFGF 0.940 0.352 0.851 4.293 1.913

　　3　讨 论


　　软骨细胞分化状态的改变直接影响软骨基质的生化成份及力学特性。稳定软骨细胞表型,促进其增殖及基质合成，在关节软骨损伤及OA治疗中具有重要意义。关节软骨及软骨下骨质中存在着包括TGF-β、IGF-Ⅰ、bFGF、PDGF等多种生长因子。在局部调节着软骨细胞的分化及代谢［4］。由于以往的研究对象、组织来源以及细胞分化程度和培养条件等因素不同，结果分歧较大。因而有必要进一步研究不同生长因子对软骨细胞表型稳定性的调节，为生长因子在软骨损伤修复中的应用提供参考。


　　作者以往的研究表明IGF-Ⅰ是软骨细胞分化增殖及代谢的重要调节因子。它可促进细胞增殖及软骨特异性蛋白多糖及胶原的合成。本研究应用狭缝杂交方法，从转录水平进一步证实，在0．4％血清条件下IGF-Ⅰ作用24 h,软骨细胞α1（Ⅱ）前胶原mRNA水平有一定程度的增加，α1（Ⅰ）、α1（Ⅲ）前胶原 mRNA水平略有增加。各种前胶原mRNA相对水平无显著改变。说明IGF-Ⅰ具有稳定软骨细胞表型，促进软骨细胞分化的作用，提示在软骨损伤性疾患治疗中IGF-Ⅰ有着重要的应用前景。


　　TGF-β具有诱导未分化间充质细胞表达软骨特征性表型的作用。但其对分化软骨细胞的影响，目前尚不明确。本研究结果表明，TGF-β能够抑制软骨细胞Ⅱ型胶原的表达,结合前一部分研究，TGF-β对胶原蛋白合成的抑制作用,可以肯定TGF-β的作用发生在转录水平。但尚不能排除TGF-β对Ⅱ型胶原转录后mRNA稳定性的影响。在TGF-β促进Ⅰ型胶原表达的同时却抑制Ⅲ型胶原mRNA水平，前胶原α1（Ⅰ）／α1（Ⅱ）及α1（Ⅰ）／α1（Ⅲ）相对值升高。本研究的结果与Galera及Hortonin研究相一致。TGF-β1对胶原蛋白合成及Ⅱ型胶原基因表达的抑制，研究认为可能是调节了Ⅱ型胶原基因启动子及增强子区域中的DNA序列。Galera的研究还发现TGF-β在抑制原代软骨细胞Ⅱ型胶原表达的同时，促进了“反分化”软骨细胞Ⅰ、Ⅲ型胶原的合成，说明不同分化状态的细胞对TGF-β的反应性不同[NextPage]

［5］。


　　bFGF对来源于中胚层的细胞是一种强的有丝分裂剂，以往研究表明bFGF能够显著促进人关节软骨细胞的增殖及胶原蛋白的合成。但狭缝杂交的结果表明bFGF能够显著地抑制Ⅱ型胶原的表达，仅为对照组的0.352倍。但对Ⅰ、Ⅲ型胶原的表达无显著影响。本研究结果与Galera的结果相似。bFGF尽管能够促进细胞增殖及胶原合成,但却改变了软骨细胞的表型，这种变化从细胞形态学上也得到了反映，bFGF作用后的软骨细胞形态发生变化，出现两极性，类似于成纤维细胞。bFGF对软骨细胞表型影响的作用途径可能与TGF-β相同。其作用机理可能为①调节了Ⅱ型胶原启动子区的DNA序列；②通过增加纤维连接素（fibronectin，FN）合成，影响软骨细胞的表型，已往研究表明，TGF-β、bFGF均能促进FN的合成，FN能够抑制体外培养软骨细胞的表型［6,7］。


　　总之，本研究显示3种生长因子在转录水平调节了软骨细胞Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型胶原的合成，可为探索骨关节病发病机理及筛选、利用生长因子等药物促进损伤软骨的修复提供参考。但体内是一个极其复杂的环境，软骨细胞的分化状态还受包括局部和全身等多种因素的影响。体外研究尚不能完全反映体内的变化，因而有关生长因子作用的确切机理及其体内生物学效应有待进一步深入的研究。