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口腔黏膜上皮细胞感染白假丝酵母菌后灶性粘附激酶的活化
作者:admin 日期:2012年02月08日 来源:互联网 浏览:

核心提示:  摘要:目的初步探讨白假丝酵母菌(Candida albicans, C. albicans)侵袭口腔黏膜上皮细胞后细胞内灶性粘附激酶(Focal adhesion kinase, FAK)信息通路的改变情况。方法以Tca8113 细胞作为研究对象,用western blotting 的方法检测C. albicans 侵袭口腔黏膜上皮细胞后不同时间段细胞内液中磷酸化FAK 和总FAK 的改变。结果①在Tca8113 细胞中有微弱的总FAK 的表达,磷酸化FAK 则无表达;②磷酸化FAK 和总FAK

  摘要:目的初步探讨白假丝酵母菌(Candida albicans, C. albicans)侵袭口腔黏膜上皮细胞后细胞内灶性粘附激酶(Focal adhesion kinase, FAK)信息通路的改变情况。方法以Tca8113 细胞作为研究对象,用western blotting 的方法检测C. albicans 侵袭口腔黏膜上皮细胞后不同时间段细胞内液中磷酸化FAK 和总FAK 的改变。结果①在Tca8113 细胞中有微弱的总FAK 的表达,磷酸化FAK 则无表达;②磷酸化FAK 和总FAK 的表达在C. albicans刺激10min 后就有明显的升高,20min 达到最高峰,30min 失表达开始减弱,至120min 表达消失。结论第一次初步证实 C. albicans 侵袭口腔黏膜上皮细胞后早期可激活FAK 信息通路引起细胞的一系列改变。
  关键词:白假丝酵母菌,灶性粘附激酶,口腔黏膜上皮细胞
  白假丝酵母菌(Candida albicans, C. albicans)是人体中最常见的机会致病菌,研究者们对C. albicans 致病机制进行了大量的研究[1],一致认为C. albicans 对宿主细胞的粘附是导致白假丝酵母菌病的第一步,也是最关键的一步[2]。对C. albicans 粘附机理的研究已经很深入,但C. albicans 粘附后宿主细胞内可能发生改变则未见报道。国外最近研究发现,微生物与宿主细胞粘附后可激活细胞内信号传导系统的改变[3],而灶性粘附激酶(Focal adhesionkinase, FAK)信号系统是宿主细胞内多条信号传导通路的交汇点,可引起细胞的一系列生物学改变[4]。因此,本试验初步探讨了C. albicans 侵袭口腔黏膜上皮细胞后细胞内FAK 信号通路的变化。
  1. 材料和方法
  1.1 主要试剂
  兔抗人 FAK 多克隆抗体和兔抗人磷酸化FAK 单克隆抗体(Cell signaling Technology),BCA 蛋白检测试剂盒(pierce)均购自上海吉泰生物公司。辣根酶过氧化物酶(HRP)标记羊抗兔IgG(Santa cruze)、牛血清白蛋白(BSA)(Sigma), 购自北京中山生物公司产品。
  1.2 白假丝酵母菌复苏和菌丝的诱导
  白假丝酵母菌(ATCC 90028),接种于沙堡氏培养基中进行复苏,选取单菌落转种于含10%小牛血清的DMEM 培养基中,在37℃含5%CO2 孵箱中孵育8 小时,直到C. albicans转变为菌丝型,1000×g、4℃离心10 分钟,弃上清,用DMEM 培养基重悬,调节C. albicans浓度至1×108。
  1.3 口腔黏膜上皮细胞的复苏和培养
  将本课题组保种的 Tca8113 细胞复苏在含10%小牛血清的DMEM 培养基中,将Tca8113细胞按1×104 接种于六孔板中,3ml/孔,待细胞达到90%单层融合时用于试验。
  1.4 白假丝酵母菌感染口腔黏膜上皮细胞后细胞总蛋白的提取
  将上述浓度的 C. albicans 刺激Tca8113 细胞,并于0min、10min、20min、30min、60min、120min 时用改良的RIPA 细胞裂解液裂解细胞提取细胞内液,所有过程均在冰上进行,12000×g、4℃离心20 分钟,收集上清,BCA 蛋白检测试剂盒检测提取蛋白的浓度,-80℃冻存备用。
  为保证试验结果的可比性和可重复性,用于试验的C. albicans 和Tca8113 细胞均为同一代,且重复试验3 次。
  1.5 Western blotting
  在上述不同组及不同时间点的细胞内液中加入5×上样缓冲液,95℃,5min,然后按20ug/道蛋白量加样用于6%聚丙烯酰胺凝胶电泳,转移至PVDF 膜,5%脱脂奶粉封闭,室温1小时,加入FAK 抗体或磷酸化FAK 抗体(1:1000),4℃过夜,TBST 洗3×10min,加入二抗(1:5000),室温1 小时,TBST 洗3×10min,TBS 洗10min,用ECL 显色,曝光,冲洗胶片。
  1.6 结果分析
  所有结果用伯乐公司的凝胶成像仪及 Quantity One4.1.1 分析软件进行分析,所有数据均经SPSS11.0 统计软件分析。
  2. 结果与讨论
  FAK 是由Hanks[5]和Schaller[6]在v-Src 转染的鸡胚细胞及正常细胞中被发现的,位于整合素密集的细胞粘附区,定位于8q24,分子量为125KD[7]。FAK 是一个多功能的非受体酪氨酸激酶,它在细胞间及细胞与细胞外基质粘附中发挥着关键作用,且与胚胎发育、细胞生存、周期调控、增殖、凋亡、迁移、转移及血管生成等密切相关[8]。
  FAK 不是一种癌基因,但可在多种肿瘤细胞中呈高表达状态,而其激活形式——磷酸化FAK 则无表达,且FAK 的表达与肿瘤的浸润转移存在密切关系,抑制FAK 的表达可有效的降低肿瘤细胞的粘附和侵袭[9~11]。本试验结果也显示总FAK 在Tca8113 细胞中有较弱表达,而活化的FAK 即磷酸化FAK 在Tca8113 中无表达(0min 泳道),这与上述研究结果相一致。
  C.albicans 是人体中最常见的机会致病菌,近来随着广谱抗生素的广泛应用以及免疫缺陷患者的日益增多,念珠菌的发病率及致死率均有上升趋势。因此,越来越多的研究者将目光集中在C.albicans 上,并对其致病的第一步也是最关键的一步——对宿主细胞的粘附进行了大量的研究,但研究多集中在Ca 或和宿主细胞表面粘附受体的结构或基因上,对二者相互作用过程中宿主细胞内信号通路的研究则极为罕见。C. albicans感染Tca8113 细胞后10min 即出现了磷酸化FAK 的表达,20min 时磷酸化FAK 表达达到最高峰,从30min 开始磷酸化FAK 的表达开始回落仍维持一段时间(至60min),至120min磷酸化FAK 表达消失。因此,本试验首次初步证实了在C. albicans 侵袭口腔黏膜上皮细胞过程的短期内(10min)即可引起细胞内FAK 信号通路的活化。
  最近,阻断 FAK 功能的药物已被应用于临床治疗中[12~14],相信本试验结果为治疗日益增多的C. albicans 感染可指出新的防治策略。

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  参考文献
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  [3]Reddy MA, Wass CA, Kim KS, et al. Involvement of focal adhesion kinase in Escherichia cooli invasion ofhuman brain microvascular endothelial cells. Infect Immun,2000,68(11):6423-6430.
  [4]Tramura M, Gu JG, Takino T, et al. Tumor suppressor PTEN inhibition of cell invasion, migration and growth:differential involvement of focal adhesion kinase and p130. Cancer Res,1999,59(2):442-449
  [5]Hands SK, Calalb MB, Harper MC, et al. Focal adhesion protein-tyrosine kinase phosphorylated in response tocell attachment to fibronectin. Proc Natl Acad Sci USA,1992,89(18):8487-8491.
  [6]Schaller MD, Borgman CA, Cobb BS, et al. pp125 FAK a structurally distinctive protein-tyrosine kinaseassociated with focal adhesions. Proc Natl Acad Sci USA,1992,89(11):5192-5196.
  [7]Schaller MD, Parsons JT. Focal adhesion kinase: an integrin-linked protein tyrosine kinase. Trends Cell Biol,1993,3(8):258-262.
  [8]Ilic D, Furuta Y, Kanazawa S, et al. Reduced cell motility and enhanced focal adhesion contact formation incells from FAK deficient mice. Nature,1995,377(6549): 539-544.
  [9]Cancer WG, Harris JE, Iacocca MV, et al. Immunohistochemical analyses of focal adhesion kinase expressionin benign and malignant human breast and colon tissues:correlation with preinvasive andn invasive phenotypes.Clin Cancer Res,2000,6:2417-2423.
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  [12]Ardizzoni A, Tiseo M. Second-line chemotherapy in the treatment of advanced non-small cell lungcancer(NSCLC). J Chemother,2004,16(suppl 4):104-107.
  [13]Bonvalot S. Surgical management of GIST in the era of Gleevec. Ann Chir, 2005,130(3):144-151.
  [14]Oneyama C, Agatsuma T, Kanda Y, et al. Synthetic inhibitors of praline-rich ligand mediated protein-proteininteraction: potent analogs of UCS15A. Chem Biol, 2003,10(5):443-451.

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