牙周炎及胃病患者牙菌斑中的幽门螺杆菌
【摘要】 目的 明确牙周炎及胃病患者的牙菌斑中是否存在幽门螺杆菌（Helicobacter pylori，Hp）及Hp是否为细胞毒素相关基因A（cytotoxin-associated gene A，cagA）阳性。方法 利用尿素酶C基因和cagA设计引物, 通过聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）检测口腔中的Hp。选择13例胃病及10例牙周炎患者，每例患者选6个有牙龈炎症的牙位取龈上、龈下菌斑，共计276份样本用于PCR检测。结果 胃病组11例患者和牙周炎组全部病例均至少有1份菌斑样本检出Hp，其中尿素酶C基因在胃病组的阳性率为28.8%（45/156），在牙周炎组为49.2%（59/120）；尿素酶C基因和cagA基因共同阳性率在胃病组为3.2%（5/156），在牙周炎组为3.3%（4/120）。取样部位Hp的检出与探诊深度及出血指数呈正相关。结论 口腔是Hp的一个聚集地。
幽门螺杆菌(Helicobacter pylori, Hp)是一种营养要求高，微需氧的革兰阴性细菌［1］。研究表明Hp是慢性活动性胃炎和胃十二指肠溃疡的主要病因，是胃癌发生的高危因子。但有关Hp的传播途径及传染源等尚未明了［2］。1989年Krajden等［3］从口腔中首次分离出Hp，此后多种方法应用于口腔中Hp的研究，但报道结果迥异。本研究依据Hp尿素酶C基因［4］和细胞毒素相关基因(cytotoxin-associated gene A，cagA)［5］设计引物，通过聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)检测取自多个牙位龈上、龈下菌斑中的Hp，旨在明确Hp是否存在于胃病及牙周炎患者的牙菌斑中、是否为cagA基因阳性的Hp菌株。
材料和方法
1.病例选择： 胃病组：主诉有上消化道症状、经北京医科大学肿瘤学院内镜室检查确诊为各种胃炎的胃病患者13例，男8例，女5例，年龄34～52岁，平均42岁，口腔检查均有牙龈炎或轻度牙周炎。牙周炎组：10例患者均选自北京医科大学口腔医学院牙周科门诊，均主诉无消化道症状，其中男5例，女5例，年龄26～52岁，平均40.7岁。两组患者均符合以下要求：①无其他系统性疾病；②3个月内未服用过抗生素及胃药；③12个月内未接受过牙周治疗；④全口牙不少于24颗。
2.取样和检查：从每例患者口腔内选择有牙龈炎症的6颗牙作为取样牙。以棉球隔湿，吹干后分别用消毒刮匙刮取龈上、龈下菌斑，即刻检查并记录牙周临床指数：菌斑指数(plaque index，PLI)、探诊深度(probing depth，PD)及出血指数(bleeding index，BI)。
3.提取DNA：按PCR试剂盒的要求快速提取菌斑样本中的DNA，将菌斑悬浮于100 μl样本处理液(BIO-RAD Co)中，56℃孵育30 min，高速震荡10 s后置100℃水浴8 min，再次高速震荡10 s，离心(12 000 r/min, 4 ℃)3 min。取上清用于PCR扩增。
4.PCR检测Hp: PCR试剂盒(Pacific Econ-Tech Co.U.S.A.）内含两对引物，预期扩增片段为294bp及400bp。20 μl反应体系含有两对引物各20 pmol/L，每种寡核苷酸4 mmol/L，DNA模板4μl，Taq DNA聚合酶2U及PCR缓冲液。反应在TMRobocycle gradient 40 型扩增仪（Stratagene公司）上进行。94 ℃预变性5 min，以94 ℃变性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min为1个循环，共计35个循环，最后1次循环72℃继续延伸7 min。以Hp标准株NCTC 11637(中国预防医学科学院陈晶晶教授惠赠)和1株Hp临床分离株（北京医科大学肿瘤学院）的DNA提取液分别作为阳性对照，采用PCR试剂盒内的阴性对照。用8％丙烯酰胺电泳鉴定PCR产物。为减少污染机会，DNA提取、PCR扩增及电泳分析分别在3个房间进行。
5.PCR敏感性和特异性试验：Hp纯培养72 小时，刮取菌落以生理盐水稀释，镜下计数测得菌液浓度。用样本处理液10倍系列稀释后使菌液每4μl含1、10、102、103、104及105个细菌，提取DNA用于PCR扩增。另外，提取牙龈卟啉菌、直弯曲菌、唾液链球菌、解脲类杆菌及大肠杆菌（均为国际标准株）的DNA，与被测样本同时进行PCR扩增。
结果
1.PCR方法的敏感性和特异性：本实验所用的PCR方法最少能检测到100个Hp细菌。扩增的上述5种其他细菌均为阴性，说明本方法敏感性和特异性较好。
2.牙周临床检查结果：胃病组的PD及BI均小于牙周炎组，胃病组分别为(2.76±0.98)mm及2.69±0.78，牙周炎组分别为 （5.74±1.42）mm及3.12±1.09，两组间比较P＜0.01，差异有极显著性。两组患者的PLI相近，胃病组为2.62±0.69, 牙周炎组为2.15±0.76，两组间比较P＞0.05，差异无显著性。
3.菌斑中的Hp检测：胃病组和牙周炎组菌斑中Hp的PCR检查结果见表1。胃病组中的11例及牙周炎组的全部患者均至少有1份菌斑样本中检出Hp，其中胃病组尿素酶C基因阳性率为28.8％（45/156），尿素酶C基因和cagA基因共同阳性率为3.2％（5/156），牙周炎组尿素酶C基因阳性率为49.2%（59/120），两种基因的共同阳性率为3.3％（4/120）。表2结果显示，龈下菌斑中Hp的检出率显著高于龈上菌斑(P＜0.01)。
4.Hp与牙周临床指标的相关关系：用Kendall-test分析Hp检出率与牙周临床指数的相关关系。在PD≥4mm的位点，菌斑中Hp检出率高于PD＜4mm的位点(P＜0.01)；而PD在4～5 mm处与大于6 mm处的龈下菌斑中，Hp检出率无明显差异(P＞0.05)。Hp的检出率与取样部位的BI明显相关(P＜0.05)。
[NextPage]表1 两组患者牙菌斑中幽门螺杆菌的PCR检测结果
| 组别 | 例数 | U(+) | U+C(+) |
菌斑标
本数 |
U(+) | U+C(+) |
| 例数(%) | 例数(%) | 份数(%) | 份数(%) | |||
| 胃病 | 13 | 9(69.2) | 2(15.4) | 156 | 45(28.8) | 5(3.2) |
| 牙周炎 | 10 | 7(70.0) | 3(30.0) | 120 | 59(49.2) | 4(3.3) |
| 两组合并 | 23 | 16(69.6) | 5(21.7) | 276 | 104(37.7) | 9(3.3) |
注：PCR：聚合酶链反应；U(+)：尿素酶C基因阳性；U+C(+)：尿素酶C基因及cag a基因均阳性
表2 Hp在龈上和龈下菌斑中的分布
| 组别 |
菌斑标
本数 |
龈上菌斑中Hp阳性数 | 龈下菌斑中Hp阳性数 | ||
| U(+)(%) | U+C(+)(%) | U(+)(%) | U+C(+)(%) | ||
| 胃病 | 156 | 15/78(19.2) | 3/78(3.8) | 30/78(38.5 ) | 2/78(2.6) |
| 牙周炎 | 120 | 21/60(35.0) | 2/60(3.3) | 38/60 (63.3) | 2/60(3.3) |
| 两组合并 | 276 | 36/138(26.1) | 5/138(3.6) | 68/138(49.3)* | 4/138 (2.9) |
注：Hp：幽门螺杆菌；U(+)：尿素酶C基因阳性；U+C(+）：尿素酶C基因及cag a基因均阳性；* 龈下菌斑显著高于龈上菌斑， p＜0.01
讨论 口腔菌斑复杂、特殊的生态环境及Hp复杂的营养要求，使得从菌斑中培养分离Hp较为困难[6]。近年来高敏感、高特异性的PCR技术已成功地用于检测菌斑和唾液中的Hp［7］。然而许多研究即便运用PCR方法也未能从菌斑中检测出Hp［8］。这些研究结果的不同，原因之一是菌斑取样部位及方法的差异,许多研究对龈上菌斑和龈下菌斑不加区别，没有考虑牙位特异性，而不同取样方法（纸捻法、牙签法、刮匙法）获取的菌斑成分的质和量差异甚大。原因之二可能与采用的DNA提取方法及PCR引物设计不同有关。基于Hp的不同特异基因如尿素酶基因，16SrRNA，特异26 000蛋白的编码基因和随意选择的DNA片段的引物设计建立了多种PCR方法，从菌斑中获取和纯化Hp DNA的不同方法可以造成最终DNA模板质和量的差异，直接影响了PCR检测的结果[6]。本研究中，我们从每例患者口腔中取6个牙位的龈上、龈下菌斑共12份样本，多份样本的分别检测减少了假阴性率；以快速提取法获取菌斑样本中的DNA，损失量较小；本研究选用美国市售PCR试剂盒，扩增的两段目的基因(urease C 基因：294bp, cagA基因：400bp)，其特异性已由Bickley等[4]及Lage等［5］通过杂交和酶切得到证实；本实验有约3%的标本为两个基因片段均阳性，而阴性对照组所用的一些可能产生尿素酶的细菌却未能扩增出，综上分析，本组结果的可信性较高。另外从本研究的两组患者血清和龈沟液中检测出抗 Hp的IgG抗体（将在另文报道），也是有力佐证。本研究中胃病患者的牙菌斑中Hp检出率为28.8％(尿素酶C基因阳性)，与Mapstone等[7]报道用巢式PCR检测的结果（23.8%）相近。
以往对非胃病人群菌斑内Hp的研究仅有少量报道，Majmudar等[9]从健康人菌斑中培养分离出Hp(100％)，而Asikainen等[8]用PCR法检测336例牙周炎患者的1 000份菌斑，均未检出Hp。本研究从无主诉消化道症状的牙周炎患者的菌斑中也检出Hp(49.2%)。值得一提的是，来自不同研究结果的差异除上面分析的原因外，Hp感染还可能与种族、饮食、教育、经济状况等的差异有关[10]。
我们还首次初步分析了菌斑中Hp的存在与牙周袋的深度及炎症状况的关系。结果提示从受检者的多个存在炎症、中等深度的牙周袋处取样有可能提高Hp的检出率。我们的研究结果支持菌斑是Hp的另一个生存环境的假说。尽管如此，口腔内Hp究竟从何而来、在牙周病的发生和发展中起何作用及其与胃内Hp感染的关系等，尚需进一步研究。
参考文献
[1] Warren JR, Marshall BI. Unidentified curved bacilli on gastric epithelium in active chronic gastritis. Lancet, 1983, 1: 1273.
[2] Tursi A, Cammarota G, Papa A, et al. The modes of transmission of Helicobacter pylori infection. Recent Prog Med，1997， 88: 232-236.
[3] Krajden S, Fuksa M, Anderson J， et al. Examination of human stomach biopsies, saliva， and dental plaque for Campylobacter pylori. J Clin Microbiol, 1989, 27:1397.
[4] Bickley J, Owen RJ, Fraser AG, et al. Evaluation of the polymerase chain reaction for detecting the urease C gene of Helicobacter pylori in gastric biopsy samples and dental plaque. J Med Microbiol, 1993, 39：338-344.
[5] Lage AP, Godfroid E, Fauconnier A ，et al. Diagnosis of Helicobacter pylori infection by PCR: comparison with other invasive techniques and detection of cagA gene in gastric biopsy specimens. J Clin Microbiol, 1995, 33: 2752-2756.
[6] Nguyen AM, Zaatari FA, Graham DY, et al. Helicobacter pylori in the oral cavity: a critical review of the literature. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod， 1995，79:705-709.
[7] Mapstone NP, Lynch DA, Lewis FA, et al. Identification of Helicobacter pylori DNA in the mouths and stomachs of patients with gastritis using PCR. J Clin Pathol ，1993， 46:540.
[8] Asikainen S, Chen C, Slots J. Absence of Helicobacter pylori in subgingival samples determined by polymerase chain reaction. Oral Microbiol Immunol, 1994, 9:318-320.
[9] Majmudar P, Shah SM, Dhunjibhoy KR, et al. Isolation of Helicobacter pylori from dental plaques in healthy volunteers. Indian J Gastrienterol, 1990, 9:271-272.
[10] Madinier IM, Fosse TM, Monteil RA, et al. Oral carriage of Helicobacter pylori: a review. J Periodontol，1997:68:2-6.