龈下菌斑中牙龈卟啉菌与伴放线放线杆菌不同基因的检测与临床症状的关系

摘 要 目的：探讨慢性牙周炎患者龈下菌斑中牙龈卟啉菌(porphyromonas gingivalis,Pg)和伴放线放线杆菌(actinomycetemcomitans actinobacillus,Aa)所携带的不同基因与临床症状间的关系。方法：采用PCR对66位患者127例龈下菌斑中的Pg 16SrDNA基因、prtC基因、fimA基因以及Aa 16SrDNA基因、1ktA基因和fap基因进行检测；并对上述基因的检出与牙周袋深度、牙槽骨吸收程度、松动度以及牙龈指数(gingival index,GI)和菌斑指数(plaque index,PLI)间的关系进行了统计分析。结果：在127例龈下菌斑中，Pg 16SrDNA、prtC和fimA的阳性率分别为90.6%、81.9%和78.0%，Aa 16SrDNA、1ktA和fap的阳性率分别为92.1、81.1%和29.9%。fimA阳性率与牙周袋深度有关(P=0
.004),在大于7 mm的牙周袋中阳性率最高(P＜0.05)。Pg prtC、fimA和Aa fap的检出率都与GI有关(P＜0.05)。Aa fap阳性率与PLI有关(P=0.002)。结论：fimA在较深的牙周袋中更易检出。Pg partC和Aa fap可能与轻度炎症有关。
关键词 慢性牙周炎 龈下菌斑 牙龈卟啉菌 伴放线放线杆菌 聚合酶链式反应 症状

Relationships between clincal symptoms and detection of different genes of Porphyromonas gingivalis and Actinomycetemcomitans actinobacillus in subgingival plaques
Wu Yanmin,Chen Lili,Yan Jie,et al.the 2nd Affiliated Hospital,College of Medical Sciences,Zhejiang University,Hangzhou 3100009,China
Abstract:Objective:To find the relationships between clinical symptons of chronic periodontitis and frequencies of different genes of Porphyromonas gingivalis (Pg) and Actinomycetemcomitans actinobacillus in subgingival plaques.Methods:Polymerase chain reaction assays were used to detect Pg 16SrDNA gene,collagenase gene (prtC),fimbrillin gene (fimA),Aa 16SrDNA gene,leukotoxingene (lktA),and fimbriae associated protein gene (fap) in 127 subgingival plaque samples from 66 chronic periodontitis patients.The relationships between the detection rates of these genes and clinical parameters such as pocket depth,alveolar bone resorption,tooth movement,gingival index (GI) and plaque index (PLI) were statistically analyzed.Results:In 127 subingival plaque samples,the positive rates of Pg 16SrDNA,prtC,fimA,Aa 16SrDNA,lktA and fap gene detection were 90.6%,81.9%,78.0%,92.1%,81.1% and 29.9% respectively.The positive rate of fimA was highest when pocket was deeper than 7 mm (P＜0.05).The positive detection rates of prtC,fimA and fap were found to be associated with GI (P＜0.05).The posi
tive rate of fap has something to do with PLI (P=0.002).Conclusion:fimA genewas more easily found in deep pockets.prtC and fap may play a role in slight inflammation of periodontal tissue.
Key Words:Chronic periodotitis; Subgingival plaque; Porphyromonas gingivalis; Actinomycetemcomitans actinobacillus; Polymerase chain reaction (PCR); Sympton

    通常认为牙龈卟啉菌(porphyromonas gingvialis,Pg)和伴放线放线杆菌(actinomycetemcomitans actinobacillus,Aa)是慢性牙周炎(chronic periodontitis,CP)的主要病原菌。在龈下菌斑中检测Pg和Aa对于牙周炎的诊断、疗效判断以及预防等方面均有重要意义。Pg和Aa临床分离菌株毒力基因的携带及表达情况存在差异［1，2］，故检测Pg和Aa毒力基因有助于阐明Pg和Aa的致病机理。16SrDNA基因具有高度保守性和种特异性，故常在PCR中作为不同种类细菌鉴别的靶基因。本文采用PCR方法检测了Pg16SrDNA基因、胶原酶基因(prtC)和菌毛基因(fimA),以及Aa 16SrDNA基因、白细胞毒素基因(lktA)和菌毛相关蛋白基因(fap)，并初步探讨了上述基因的检出与患者临床症状间的关系。

1 材料与方法
1.1 病例来源：66位CP患者均为本科门诊的初诊患者，就诊前1个月内未服用任何抗生素。其中男性22名，平均年龄45.6岁，女性42名，平均年龄37.1岁。

1.2 临床资料记录：记录患牙的牙周袋深度、牙槽骨吸收程度、松动度以及牙龈指数(gingival index,GI)［3］、菌斑指数(plaque index,PLI)［4］。
1.3 龈下菌斑标本的采集和处理：在66位患者中共采集了127例龈下菌斑标本。采集的龈下菌斑置于200 μl TE缓冲液中，-20℃保存。临用前解冻，加入终深度为1%(v/v)的Triton X100 (Serva)，混匀后100℃水浴10 min,取10 μl上清液作为PCR的模板。
1.4 PCR引物：Pg 16SrDNA引物［5］：5′AGGCAGCTTGCCATACTGCG3′(sense)，5′ACTGTTAGCAACTACCGATGT3′(antisense)。Pg prtC引物［6］：5′ACAATCCACGAGACCATC3′(sense),5′TTCAGCCACACCGAGACG3′(antisense)。Pg fimA引物［7］：5′ATAATGGAGAACAGCAGGAA3′(sense),5′TCTTGCCAACCAGTTCCATTGC3′(antisense)。Aa 16SrDNA引物［5］：5′GCTAATACCGCGTAGAGTCGG3′(sense),5′ATTTCACACCTCACTTAAAGGT3′(antisense)。Aa lktA引物［8］：5′TCGCGAATCAGCTCGCCG3′(sense),5′GCTTTGCAAGCTCCTCACC3′(antisense)。Aa fap引物［9］：5′ATTAA ATACTTTAACTACTAAAGC3′(sense),5′GCACTGTTAACTGTACTAGC3′(antisense)。引物由Sangon公司合成。预期Pg 16SrDNA、prtC和fimA扩增产物长度分别为404、584和131 bp。Aa 16SrDNA、lktA和fap扩增片段预期大小为443、285和210 bp。引物均由Sangon公司合成。
1.5 PCR反应条件和对照设置：①Pg 16SrDNA:反应总体积100 μl，内含10 μl模板、10 μl 10×PCR缓冲液(pH 8.4)、25 pmol引物、1.5 mmol/L MgCl2、0.25 mmol dNTP、0.001%(w/v)明胶和2.5 U Taq酶(Gibco BRL)：PCR参数为：94℃ 5 min×1,94℃ 1 min、58℃ 1 min、72℃ 1.5 min,×35，72℃ 7 min×1；②fimA：除引物深度为50 pmol、MgCl2浓度为2.5 mmol/L退火温度为52℃外，其余均与Pg 16SrDNA检测相同；③prtC:除MgCl2浓度为2.5 mmol/L和退火温度为50℃外，其余均与Pg 16SrDNA检测相同；④Aa 16SrDNA:除MgCl2浓度为2.5 mmol/L和退火温度为60℃外，其余均与Pg 16SrDNA检测相同；⑤Aa lktA:除退火温度为55℃外，其余均与Pg 16SrDNA检测相同；⑥fap:除引物浓度为50 pmol、MgCl2浓度为1.5 mmol/L和退火温度为50℃外，其余均与Pg 16SrDNA检测相同；采用Thermal Cycler 480 (Perkin Elmer)进行扩增。检测Pg prtC和fimA时以Pg ATCC33277 DNA作为阳性对照，以Aa Y4 DNA为阴性对照，等体积超纯水作为空白对照。检测Aa lktA和fap时以Aa Y4 DNA为阳性对照，以Pg ATCC33277 DNA为阴性对
照，等体积超纯水作为空白对照。

1.6 PCR的敏感性：用GeneQuant Ⅱ RNA/DNA Calculator (Pharmacia Biotech)测定Pg ATCC3327株DNA提取物260 nm处的OD值，按下列公式计算DNA浓度：DNA浓度(μg/ml)=OD260×50×稀释倍数。将已知DNA浓度的模板连续10倍稀释后进行扩增。
1.7 扩增产物检测：用含1 μg/ml溴乙锭的2%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，用123 bp Marker(Gibco BRL)估计产物长度。
1.8 统计方法：采用SPSS9.0软件进行统计分析。

[NextPage]2 结 果
2.1 PCR的敏感性
    本文建立的PCR至少可检出0.1 ng DNA中的Pg 16SrDNA和Aa 16SrDNA,fimA、prtC和lktA的PCR检测敏感性均为0.1 ng DNA,fap则为100 ng DNA。上述基因PCR扩增结果见图1和图2。

图1 Pg 16SrDNA、prtC和fimA基因
PCR检测结果注：泳道1和2：16SrDNA阴性对照和阳性对照，泳道3：龈下菌斑标本的16SrDNA扩增结果，泳道5和6：prtC阴性对照和阳性对照，泳道7：龈下菌斑标本的prtC扩增结果，泳道9：Marker，泳道10和11：fimA阴性对照和阳性对照，泳道12：龈下菌斑标本的fimA扩增结果，泳道4、8、13：空白对照。

图2 Aa 16SrDNA、lktA和fap基因P
CR检测结果注：泳道1和2：16SrDNA阴性对照和阳性对照，泳道3：龈下菌斑标本的16SrDNA扩增结果，泳道5和6：lktA阴性对照和阳性对照，泳道7：龈下菌斑标本的lktA扩增结果，泳道9：Marker，泳道10和11：fap阴性对照和阳性对照，泳道12：龈下菌斑标本的fap扩增结果，泳道4、8、13：空白对照。

2.2 PCR的阳性率
127例患牙的龈下菌斑标本中，Pg 16SrDNA、prtC和fimA的阳性率分别为90.6%、81.9%和78.0%，Aa 16SrDNA、lktA和fap的阳性率分别为92.1%、81.1%和29.9%。

2.3 Pg和Aa各基因PCR检测阳性率与临床症状之间的关系
2.3.1 与牙周袋深度的关系
fimA阳性率与牙周袋深度有关(χ2=10.952,P=0.004)。当牙周袋深度大于7 mm时,fimA阳性率最高(P＜0.05)(见表1)。未发现其余各基因阳性率与牙周袋深度间有何关系。
表1 牙周袋深度与fimA阳性率间的关系

牙周袋深度(mm)样本数
fimA (-)(+)阳性率
333132060.6%
4～660134778.3%
＞73423294.1%
合计127289978.0%

2.3.2 与GI的关系
PCR结果发现Pg prtC检出率与GI有关(χ2=6.686,P=0.035)，当GI=1时，prtC阳性率高于GI=2时的prtC阳性率(χ2=6.630,P=0.010)。GI不同时fimA的检出率存在差异(χ2=11.635,P=0.003)，GI=2时，fimA阳性率低于其余2组(P＜0.01)。GI不同时fap的检出率也存在差异(χ2=12.143,P=0.002)，GI=1时，fap阳性率高于其余2组(P＜0.01)(见表2)。未发现其余基因阳性率与GI有何关系。

表2 GI与Pg prtC、fimA和Aa fap基因的PCR阳性率间的关系

GI样本数
prtC(-)(+)阳性率
fimA(-)(+)阳性率
fap(-)(+)阳性率
13113096.8%32890.6%141754.8%
255144174.5%203563.6%431221.8%
34183380.5%53687.8%32921.9%
合计1272310481.9%289978.0%893829.9%

 

2.3.3 与PLI的关系
fap阳性率与PLI有关(χ2=12.595,P=0.002)。PLI=1时，fap阳性率最高(P＜0.05)(见表3)。未发现其余各基因阳性率与PLI间有何关系。
表3 PLI与fap阳性率间的关系
PLI样本数
fap(-)(+)阳性率
138191950.0%
246331328.3%
34337614.0%
合计127893829.9%

2.3.4 其他
未发现各基因检出与其他临床症状(牙槽骨吸收程度、松动度)有何关联。

[NextPage]3 讨 论
    Pg与Aa是无芽胞厌氧菌，培养要求高，周期长，易污染且阳性率较低。90年代以来，国外一些学者开始采用PCR进行临床标本中牙周病原菌的检测，该方法操作简单，且具有快速、敏感性和特异性高等优点。本文所采用的Pg 16SrDNA、prtC、fimA和Aa 16SrDNA、lktA引物序列国外文献均有报道［5～8］，Aa fap引物则参考文献后自行设计［9］。本文结果表明PCR检测上述基因具有较高的敏感性。

    由于Pg菌毛和胶原酶、Aa菌毛和白细胞毒素在牙周炎发生和发展过程中发挥了重要作用，本文对上述基因进行了PCR检测，并对检测结果与CP临床症状间的关系进行了分析。不仅包括了CP的典型症状如牙周袋深度、牙槽骨吸收程度和松动度，且对GI和PLI这两个反映牙龈炎症程度和患牙口腔卫生情况的指标进行了分析，较全面地反映了各基因检测和患牙病变程度间的关系。尽管未发现牙槽骨吸收程度和松动度这两个牙周炎重要临床症状与某一毒力基因检测间有何关系，但其余各指标均与一个或几个基因的检测有关。

    菌毛是Pg的重要致病因子，可使Pg与其他细菌发生共聚、粘附于人细胞外基质蛋白及人口腔上皮细胞、诱导牙槽骨吸收、诱生细胞因子、协助Pg入侵上皮细胞并影响细胞免疫反应［10，11］。Watanabe等(1993)首先设计了检测Pg菌毛蛋白亚单位的结构基因(fimA)的特异引物，通过扩增可获得131 bp产物［7］。一般认为fimA的检出与GI和探诊深度弱相关［7］。Amano(1999)等报道在深袋(≥8 mm)中Ⅱ型fimA基因的更易检出［12］。本文结果发现牙周袋深度在7 mm以上时fimA阳性率最高，且GI=2时fimA阳性率最低，与上述报道基本一致，提示fimA基因在中度炎症的深袋中更易检出。

Pg产生的另一重要致病物质是胶原酶，该酶可破坏牙周组织中的Ⅰ型和Ⅳ型胶原［13］。prtC为编码Pg胶原酶的基因。本文结果发现prtC的阳性率与GI有关，GI=1时，阳性率较高，提示可能牙龈炎症较轻时Pg胶原酶所起的作用更大。

    Aa是迄今唯一检测到的具有白细胞毒素的口腔厌氧菌，产白细胞毒素的能力与该菌毒力成正相关［8］。lktA为编码该毒素的基因，目前认为所有Aa菌株都具有lktA基因［8］。本文未发现该基因检测与临床症状有何关系。

    Aa也具有菌毛，但其生物学特性及基因结构等目前知之甚少。Ishihara等(1997)首先对菌毛相关蛋白基因(fap)进行了克隆测序［9］。本文结果发现Aa fap的PCR阳性率与GI和PLI有关。GI=1时或PLI=1时fap检出率较高，说明可能与轻度炎症有关。

    由于16SrDNA为编码细菌rRNA的基因，与细菌毒力无关，因此本文结果中Pg或Aa的16SrDNA检测与临床症状无关。上述推论均有待进一步研究证实。

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