新型纳米根管充填材料体外基因毒性的初步研究
叶 玲 ,苏 勤 ,周学东 ,谭 红
(四川大学华西口腔医院 牙体牙髓科 ,四川 成都 610041)
[摘要] 目的 采用体外微核法评价新型纳米根管充填材料 nHA- PA66的基因毒性。方法 以 V79细胞作为实验
细胞 ,采用新型纳米根管充填材料 nHA- PA66 粉剂及混合物的浸提液作为实验组 ,丝裂霉素 C为阳性对照组 ,用
MTT法检测各组的细胞毒性 ,以 V79细胞中所形成的微核数作为标准评价材料的基因毒性。结果 实验组的 MTT
值在各个时间段与阴性对照组无显著性差异( P > 0105) ;所形成的微核数(粉剂组 :611±111?1 000 ;混合物组 :517±
016?1 000)与阴性对照组(513±018?1 000)无显著性差异( P > 0105) ,而与阳性对照组(12319±8?1 000)有显著性差异
( P < 0105) 。结论 本实验显示新型纳米根管充填材料 nHA- PA66无细胞毒性及基因毒性 ,生物相容性好。
[关键词] 体外微核法 ; 基因毒性 ; 纳米材料
[中图分类号] R 781. 05 [文献标识码] A
G enotoxicity of a New N anoHA – PA66 Root Fi lling Material in vitro YE Ling , SU Qin , ZHOU Xue – dong , TAN Hong.
( Dept . o f Endodontics , West China College o f Stomatology , Sichuan Univer sity , Chengdu 610041 , China)
[Abstract ] Objective The micronucleus test was applied to evaluate the genotoxicity of a new nanocomplex HA – PA66 root
filling material in vitro. Methods The dulbecco′ s modi fied eagle media (DMEM) extracts of the powder part and the mixture of
the new nanomaterial were prepared separately. The V79 cell was used as the test cell and the mitomycin C(MMC) as the positive
control . The MTT assay was employed in our study to evaluate the cytotoxic effect while the number of micronucleus was used as
the criteria for the detection of genotox ocity. Results The MTT values in test groups and negative group were not signi ficantly di f2
ferent at di fferent times ( P > 0. 05) . The number of micronucleus in test groups (powder group : 6. 1 ±1. 1?1 000 ; complex
group : 5. 7±0. 6?1 000) was similar to the negative control (5. 3±0. 8?1 000 , P > 0. 05) , while they were signi ficantly di fferent
to the positive control (123. 9±8?1 000 , P < 0. 05) . Conclusion The new nanocomplex HA- PA66 root filling material showed no
detectable cytotoxic and genotoxic effects in this study and was proved to be biocompatible.
[ K ey words] in vitro micronucleus ; genotoxicity ; nanomaterial
1
随着牙科材料及器械的发展 ,现代根管治疗将重点放在了根管预备和根管充填上。只有充分、 有效而严密的根管充填才能达到根管治疗的最终目的 — — —治疗或预防根尖周疾病的发生。根据 ISO-10993 标[1 ]准 ,根管充填材料属于永久性的植入材料 ,必须具有良好的生物相容性。新型根管充填材料在临床使用前 ,必须进行生物相容性检测 ,包括组织学、 细胞学、 基因及分子学等不同水平的生物学评价。其中 ,基因毒性主要包括基因突变、 染色体异常或基因组的改变 ,其检测可通过体外及体内实验进行 ,其中体外实验由于操作方便及代表性强而多用作初步筛选实验。细胞水平的基因毒性主要表现为染色体量及结构的异常 ,体外微核法 (micronucleus test in vitro ,MNT)是最常用于检测染色体异常的实验方法。新型1 1 ?1 1 1 ?司 ,美国) ;细胞培养仪( INFO-3公司 ,日本) 。
1. 2 细胞来源 V79细胞(四川大学华西公共卫生学院提供) 。
1. 3 材料浸液的制备采用细胞培养液 DMEM制备新型纳米根管充填材料 nHA- PA66 的浸提液。材料经高温高压消毒灭菌 ,DMEM培养基经滤过除菌 ,将材料的粉剂和粉、 液混匀后固化 24 h的混合物粉碎后 ,各取 1 g分别加入 10 ml 细胞培养基DMEM中。振荡混匀后在细胞培养孵箱中 37 ℃ 放置 7 d ,离心后取出上清液 ,再进行梯度稀释(初始浓度相当于材料?浸液∶ 100 mg?ml) ,滤过除菌后备用。
1. 4 细胞毒性试验(dimethylthiazol diphenyltetrazolium assay , MTT) 本实验分为实验组和对照组 ,实验组细胞中加入材料浸提液 ,对照组加入细胞培养基 DMEM。实验组又根据材料浸液的不同而分为粉剂组 ( P)和混合物组(M) ,两组的系列稀释又产生了 P 1、 P 2、 P 3、 P 4、 P 5组和M 1、 M 2、 M 3、 M 4、 M 5组。P 1组材料粉剂浸液浓度 100 mg?ml ;M 1 组材料混合物浸液浓度 100 mg?ml ; P 2及M 2 组浓度为 50 mg?ml ; P 3 及 M 3 组浓度为 25 mg?ml ;P 4及 M 4组浓度为 1215 mg?ml ; P 5及 M 5组浓度为 6125 mg?ml。 4 将V79细胞复苏后 ,以 10 个?毫升的浓度接种于 96孔细胞培养板中 ,每 3孔 1组 ,加入 DMEM培养基、 10 %小牛血清及青链霉素 ,在含 5 %CO 2 空气、 37 ℃ 下培养。24 h细胞贴壁后 ,更换细胞培养基 ,实验组每孔加入 200μl 不同浓度的材料浸提液 ,阴性对照组中加入新鲜 DMEM培养基;分别培养 1、 3、 5 d后每孔加入MTT ,4 h后中止反应 ,进行分光光度计读数 ( λ= 570 nm) 。
1. 5 体外微核试验(micronuleus test , MNT) 本实验分为实验组、 阳性对照组和阴性对照组 , 实验组加入 5 ml 粉剂和混合物的初始浓度浸提液 (100 mg?ml) ;阳性对照组加入 5μg?ml 的 CTC + S9 ,阴性对照组加入 DMEM培养基。 4 将 V79 细胞以 10 个?毫升的浓度接种于细胞培养皿中的玻片上 ,每个培养皿中放入 3 块 (1 cm × 1 cm)玻片。同 114 培养条件下培养 24 h 细胞贴壁后 ,更换培养基 ,按实验分组加入不同的试剂。再培养 24 h ,终止反应。将玻片取出 ,甲醇和冰醋酸(3∶ 1) 固定后 ,PBS洗涤 ,用 G iemsa染色 ,自然晾干后用树胶封片。在显微镜下观察并计算微核的数目。每张片子计数 2 000个细胞 ,所得的微核数目取均值作为该组的数据。
1. 6 统计分析采用单因素方差分析进行数据的统计分析。
2 结果
[NextPage]2. 1 细胞毒性实验结果细胞毒性实验结果见表 1。实验组中无论是粉剂组还是混合物组 ,各浓度对细胞未表现出毒性作用 ,各时间段 MTT值均与阴性对照组无显著性差异 ( P > 0105) 。表 实验结果 1 MTT T ab 1 Results of MTT assay 时间( ) d 组别 1 3 5 对照组 0. 124±0. 020 0. 255±0. 010 0. 401±0. 030 P 1 0. 120±0. 100 0. 248±0. 090 0. 396±0. 130 ± ± ± P 2 0. 119 0. 110 0. 249 0. 150 0. 398 0. 060 P 3 0. 122±0. 030 0. 245±0. 120 0. 401±0. 080 P 4 0. 121±0. 020 0. 252±0. 060 0. 402±0. 210 P 5 0. 125±0. 010 0. 256±0. 030 0. 404±0. 070 M 1 0. 124±0. 070 0. 245±0. 200 0. 401±0. 330 M 2 0. 119±0. 080 0. 252±0. 130 0. 399±0. 190 M 3 0. 121±0. 040 0. 251±0. 050 0. 400±0. 310 M 4 0. 123±0. 120 0. 255±0. 140 0. 403±0. 170 M 5 0. 126±0. 110 0. 257±0. 200 0. 405±0. 330 2. 2 微核实验结果图 1箭头所示即为所形成的微核 — — — 细胞质内的染色体样物质 ,计算微核形成数量时是在高倍镜下 ( ×40) ,随机视野下计数 1 000 个细胞中的微核数。每张玻片计数 3次取平均值 ,而每组 3张玻片的均值为该组的微核数。无论是粉剂组(6 1 ±1 1 1 000)还是混合物组(5 7 ±0 6 1 000) ,其浸1 提液所 1 ?诱导的微核数目与阴性对 1 照组 1(?5 3 ±0 8 1 000)无显著性差异 ( P > 0 05) ,而与阳性对1 照组( 1 12 ?3 9±8 1 000)有显著性差异 1( 1 ? P < 0 05) ,说明该新型纳米材料未表现出基因毒性。 1 图 1 阳性对照组所形成的微核 姬姆萨染色 ×40 Fig 1 Micronucleus formed in the positive control G iemsa ×403 讨论体外微核法作为检测基因毒性用于毒理研究已得到公认 ,近年来随着口腔新材料的不断涌现 ,对口腔材料的毒理研究也日益受到重视。作为长期存留于口腔内的根充材料 ,其生物相容性的好坏将直接影响根充的质量及根尖周组织的修复反应。除了细胞及组织毒性的研究外 ,牙科材料的基因毒性也被认为 [3 ] 是评价新型材料的必须步骤 。大量研究表明体外微核法应成为口腔新型材料临床应用前的生物相容性研究的不可缺少的一部分 ,体外微核法对于检测新材料的基因毒性有很好的敏感性和特异性 ,且简单易 [4 ] 行、 可自动化计数及重复性好 。利用特殊的细胞系 ,它可敏感的表现在材料的影响下细胞所发生的染色体结构和数量上的异常变化。V79 细胞是中国仓鼠肺成纤维细胞 ,是永生细胞系 ,当其接触有基因毒性的材料时 ,其染色体分裂发生障碍 ,出现染色体的断裂或滞后 ,导致在分裂后期染色体不能正常分配到子代细胞中 ,从而表现出细胞质中的染色体样物质 — — — 微核 ,通过微核数量的多少可判断出材料的染色 [5 ] 体毒性 。本实验采用了材料的培养基浸提液来评价材料的基因毒性 ,有研究表明当对材料的毒性作用进行研究时 ,可用材料的浸提液代表材料本身 ,其可析出成分对实验细胞的作用能较好的反映材料成分的作 [6 ] 用 。本实验为了避免其他化学提取液本身对 V79 细胞作用的干扰 ,采用了细胞培养基作为材料的浸提液。在毒理试验中 ,通常需在进行基因毒性实验前先进行细胞毒性实验 ,以确定实验材料抑制 30 %～ 80 %细胞生长的浓度 ,再选其范围内的浓度作为基因毒性的实验浓度 ,本实验中的 MTT实验即是此目的。本实验中新型纳米根管充填材料 nHA- PA66 由粉液两组分构成 ,粉剂主要是纳米羟磷灰石与聚酰胺的复合物 ,液剂为聚合反应的启动成分。当两组分混合后即开始聚合反应 ,材料的流动性逐渐降低而硬固 ,并 [2 ] 伴有一定的体积微膨胀 。有研究显示高分子类根充材料在聚合反应开始至 24 h 其细胞毒性逐渐上 [7 ] 升 ,其后开始下降 ,本实验采用单纯粉剂和固化 24 h的混合物的浸提液作为材料的代表。实验结果表明新型纳米根充材料并未表现出细胞毒性 ,实验组细胞与对照组的线粒体活性在相同时间段均无显著性差异 ,而阴性对照组仅为 V79 细胞培养基 ,说明材料对细胞的生长无抑制作用。微核的计算结果表明材料也无基因毒性 ,由于本实验中材料的浸提液在最高浓度时也并未表现细胞毒性 ,所以在进行基因毒性logy Vol . 22 No. 2 April ,2004 ·95 · 实验时 ,笔者采用了最高浓度作为实验浓度。粉剂及混合物组导致的微核数与阴性对照组相比均无显著性差异 ,而阳性对照组形成的微核数为前者的 18 倍 [8 ] 左右 ,这与以往文献报道一致 ,说明材料无基因毒性。新型纳米根管充填材料 nHA- PA66 在本实验中均未表现出细胞毒性及基因毒性 ,这可由材料的成分得到解释。纳米羟磷灰石是纳米化的羟磷灰石 ,与常规羟磷灰石相比 ,纳米羟磷灰石韧性和物理力学性能 [2 ,3 ] 都大大增强 ,生物相容性及生物活性较前者好 。聚酰胺的生物相容性已得到证实 ,它作为外科用缝线已在临床应用多年 ,能被人体很好的耐受 ,所以它又被称为生物惰性材料。因此作为两者的复合物的新型纳米根管充填材料 nHA- PA66 也具有良好的生物相容性 ,而且由于该复合材料在结构及性能上与人体硬组织的相似性 ,被称为仿生材料 ,其不同的类型的生物活性及生物相容性已在骨科得到临床前期实验验证。本实验的结果也提示该材料可用于口腔。由于体外实验本身的局限性 ,在将新材料应用于临床前应进行系统性的实验研究 ,而不能根据某方面或某个水平的结果就得出生物相容性的结论。本实验是系列实验的一部分 ,对该材料的客观评价将有赖于对从细胞到动物实验结果的综合评价。
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