大鼠牙周炎牙正畸移动后整合素β3mRNA变化的实验研究
摘要：目的 对大鼠牙周病与正常牙正畸移动中整合素β3mRNA表达变化进行研究。 方法 用原位杂交方法检测牙周病与正常牙正畸移动后β3mRNA转录水平的变化。结果 正常牙与牙周炎牙移动后12小时与3天后，牙周膜内破骨细胞整合素β3 mRNA有阳性表达，但表达较弱。在牙槽骨内的骨髓腔内有大量细胞有整合素β3 mRNA的阳性表达，且表达较强。结论 在正常牙移动及牙周炎牙移动中，整合素β3参与破骨细胞前体向破骨细胞转化及破骨细胞迁移和粘附。
关键词：整合素 整合素β3破骨细胞
1. 引言
破骨细胞表达的β3组整合素αvβ3是破骨细胞表达水平最强的整合素，是其主要粘附分子。破骨细胞整合素αvβ3配体为 VN，其介导的细胞粘附与破骨细胞的迁移分化及其与骨基质的粘附有密切关系[1]。
在牙周炎和正畸牙移动中，破骨细胞是骨吸收的核心细胞。破骨细胞整合素β3的表达是否参与了牙槽骨的改建和吸收？本实验用原位杂交方法探测整合素β3 mRNA转录水平的变化，对牙周炎与牙移动中牙周组织与整合素表达的关系进行探讨。
2. 材料与方法
2.1 实验设计
选用10周龄雄性成年SD大鼠96只（体重350g±，四川大学华西实验动物中心提供）随机分为正常牙加力组、牙周炎牙加力组。牙周炎牙齿模型在缝线缝扎和高糖饮食一个月后获得[2]。牙齿加力方法为：用结扎丝将NiTi螺旋弹簧的一端结扎于磨牙颈部，弹簧的另一端结扎于两个切牙上并用粘结剂固定，使弹簧拉伸，力量为50g，使磨牙受到近中方向的拉力，形成大鼠磨牙近中移动动物模型。分别在加力后0 天、 1天、2天、3天、5天、7天、每一时间点处死动物，每组8只。进行标本制备和组织切片。一级子标题（小四号，宋体，加粗）。
2.2 实验方法 原位杂交（In Situ Hybridzation） 。
2.2.1 主要试剂及设备
兔整合素β1，β3基因mRNA链原位杂交实验试剂盒由武汉博士德生物工程有限公司提供。
试剂盒中含有：胃蛋白酶(x10，Pepsin)、预杂交液、整合素β1，β3寡核甘酸探针杂交液、封闭液、生物素化鼠抗地高辛、生物素化抗兔IgG、SABC-POD、生物素化过氧化物酶。
原位杂交所用探针采用整合素的三相寡核甘酸探针，经地高辛高效标记。
整合素β3寡核甘酸探针序列：
(1) 5′-GACAC CTGTG AGAAG TGCCC CACCT GCCCA-3′
(2) 5′-GGATG ACTGT GTCGT CAGAT TCCAG TACTA-3′
(3) 5′-GCTAA ATTTG AGGAA AGGCG CGCCA GGAGC-3′
DEPC（美国Sigma 公司）
2.2.2 原位杂交实验方法
石蜡切片脱蜡至水，阻断内源性过氧化物酶活性，22分钟。→5％(w／w)DEPC水洗，每次5分钟，2次。→暴露mRNA核酸片段：切片上滴加3％柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶，37℃，30分钟。→5mol／L磷酸盐缓冲液PBS (phosphate buffer solution, )洗，每次5分钟，3次,DEPC水洗1次；90％、95％、100％DEPC-酒精脱水干燥。→预杂交：滴加预杂交液于组织上，在42℃湿盒中孵育4小时→杂交：将2块医用纱布用2xSSc浸湿，放入杂交盒底部。→切片空气干燥后，每张切片滴20ul含地高辛标记探针的原位杂交液。→恒温干燥箱40℃杂交过夜。12h后取出湿盒中纱布，并将湿盒开条缝隙，在干燥环境中继续杂交2-3h。
2.2.3 杂交信号的检测
用2xSSC、 0.5xSSC洗涤，10分钟，2次，→ 0.2xSSC洗涤，10分钟，2次；0．5mol/LPBS洗涤，5分钟，1次。→ 滴加封闭液，室温20分钟， 滴加兔抗地高辛37℃，60分钟→ 0.5mol/LPBS洗2分钟,3次，滴加生物素化抗兔IgG，37℃，30分钟→ 0.5mol/L PBS洗， 滴加SABC复合体，37C，30分钟→ 0.5mol/L洗5分钟，4次DAB显色，苏木素复染→酸酒精处理，流水冲洗，脱水，二甲苯透明，加拿大胶封片。
2.2.4 阳性标准
胞浆棕黄色染色，着色明显高于背景水平。
2.3 图像分析
采用尼康E600研究显微镜、SPOT COD CCD摄像头进行图象采集，image-pro plus 4.01图像分析系统软件进行统计分析。每只大鼠选用一张切片，在高倍镜下（×200）进行分析，每张切片在牙周膜区随机选择一个区域，以交互方式测量出破骨细胞整合素β3mRNA表达的平均光密度值(OD optical density)。以三次测量值的均值作为该动物在该时间的实测值。
2.4 统计学处理
对对照组和阳性染色组的切片的破骨细胞浆着色的平均光密度值进行t检验比较，对正常牙和牙周炎牙齿不同时间段的OD测量值进行单因素方差分析。
[NextPage]3. 结果与分析
3.1整合素β3 mRNA表达
两组在大多数时段并未观察到破骨细胞整合素β3 mRNA表达阳性。只在加力后12小时和第三天观察到牙周膜内破骨细胞整合素β3 mRNA有弱阳性表达，且正常牙与牙周炎牙两组加力后破骨细胞整合素β3 mRNA阳性信号强度无明显差异。正常牙与牙周病牙加力后牙周膜内破骨细胞整合素β3mRNA平均光密度值比较。
在破骨细胞完全融合形成，开始骨吸收功能后，整合素β3mRNA的合成与整合素蛋白表达均已基本完成。可能是多数时间段成熟破骨细胞未检测到整合素β3mRNA表达的原因。而在加力后12小时和3天，正是破骨细胞大量形成和开始骨粘附的时期，这时可能破骨细胞仍在进行整合素β3的合成，以完成破骨细胞迁移和破骨细胞与骨基质的粘附，开始骨吸收。在整合素β3与骨质粘附完成，骨吸收开始后，可能就不再需要整合素β3 mRNA的合成。
在牙移动后2天3天的标本牙槽骨的骨髓腔内见到大量单核或双核细胞胞浆有强烈阳性信号表达。据研究在各种促破骨细胞形成因素刺激下，破骨细胞前体单核细胞在融合形成破骨细胞时整合素β3的转录与表达水平升高[4]。在相应的切片TRAP( tartrate-resistant acid phosphatase抗酒石酸盐酸性磷酸酶)染色发现，相应的位置有一定程度的TRAP阳性染色，抗酒石酸盐酸性磷酸酶为特异性的破骨细胞表达的酶，因此推测骨髓腔内的阳性细胞可能是正在融合形成破骨细胞的破骨细胞前体。
4. 讨论
在破骨细胞膜上鉴定出来的整合素主要有αvβ3, αvβ1, α5β1, α2β1等，其中αvβ3在破骨细胞表达水平最强，是破骨细胞的主要粘附分子[1]。鼠类的破骨细胞通过整合素αvβ3与细胞外基质包括FN,VN,OPN和裂解的 I 型胶原连接。破骨细胞通过整合素αvβ3与VN粘附，是骨吸收功能的关键步骤,对整合素β3亚单位基因敲除的大鼠进行研究后发现，该型大鼠的破骨细胞无法形成正常的刷状缘和肌动蛋白环，阻碍了骨吸收的进行[3]。抗αVβ3单抗可抑制破骨细胞与细胞外基质的粘附[4]。其它细胞因子也通过调节整合素β3的表达而调节破骨细胞功能。 O’Brien[5]发现骨保护素配体（OPGL） 可刺激破骨细胞从鼠颅骨的骨膜释放和粘附于骨表面，同时有整合素β3蛋白表达的增高，而应用骨保护素（OPG）后，可以阻止破骨细胞的整合素β3蛋白表达，从而抑制破骨细胞的骨吸收。
破骨细胞成熟和开始行使功能后仍表达β3 mRNA的研究较少见。Shinar [6]用原位杂交技术在大鼠骨吸收活跃的部位的破骨细胞上发现有整合素αv和β3 mRNA的阳性表达。Faccio [7]认为在破骨细胞的不同状态中，整合素αvβ3也存在不同状态-“静止状态”与“激活状态”。在实验中，发现在静止态的破骨细胞中，激活状态αvβ3分布于细胞膜的活动区（motile areas）。而在活动状态的破骨细胞中，激活状态αvβ3分布于刷状缘，静止状态的αvβ3位于结合带（sealing zone），肝细胞生长因子（HGF）与巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）,离体条件下可以调节整合素αvβ3的构相。通过激活活性αvβ3使破骨细胞迁移并与OPN粘连，开始骨吸收。因此破骨细胞可能在早期既已经完成整合素mRNA的转录和蛋白的合成，只是在需要行使功能时进行构相的改变，激活蛋白的功能。这可能是加力后破骨细胞很少表达整合素β3 mRNA的原因。
大量研究发现整合素β3mRNA高表达于成熟前的前破骨细胞上。Medhora[8]用1,25-(OH)2D3刺激破骨细胞前体向成熟破骨细胞转化，发现加入1,25-(OH)2D3后， 24小时内细胞的整合素αv 的mRNA表达水平增高，随之而来的是破骨细胞整合素αvβ3蛋白的增高，说明破骨细胞的转化成熟过程中，有整合素αvβ3的参与。Mimura [9]报道1,25-(OH)2D3来源于单核/巨噬细胞家族的破骨细胞前体向破骨细胞转化，整合素β3的mRNA水平也在1天内表达增高，与蛋白表达水平相对应。鼠骨髓巨噬细胞（mouse marrow macrophages BMMs ）可以分化为破骨细胞。Li[10]发现在加入雌激素后，增加[1,25-(OH)2D3]诱导的破骨细胞前体细胞向破骨细胞转化，其中整合素β3 mRNA的高表达持续时间增加，认为是增加了β3 mRNA的稳定性，从而导致蛋白水平的相应增加。以上研究都说明，在破骨细胞前体向破骨细胞转化过程中，是整合素β3 mRNA合成与高表达的时期。
Rody [11]等研究认为加力后破骨细胞来源于牙槽骨骨髓，本实验发现在牙槽骨的骨髓腔内，大量的单核或双核细胞阳性表达整合素β3 mRNA，同时TRAP染色阳性。提示此部位可能是破骨细胞前体向成熟破骨细胞转化的部位，整合素在加力后12小时和第3天，β3 mRNA阳性表达，这与破骨细胞形成的高峰期相对应，提示整合素β3 mRNA阳性表达似乎与破骨细胞的成熟、聚集有关。
参考文献
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