体外牙髓干细胞定向分化为成牙本质样细胞的模型研究

　　摘要：以牙髓干细胞（DPSCs）为种子细胞，以处理后的牙本质磨片为支架体外构建成牙本质样细胞分化模型，评价该模型对DPSCs 定向分化为成牙本质样细胞的有效性。I 型胶原酶消化组织块法体外培养DPSCs，鉴定细胞来源和干细胞表面标记；以经过处理的牙本质磨片为支架接种DPSCs，在接种后的第1、2、4、8 天分别收集细胞，用扫描电镜和免疫荧光显微镜观察细胞在分化模型中的形态学变化及微丝结构的改变；收集接种后的第1、3、6、8、10 天的细胞，行MTT 法定量测定DPSCs 在分化模型中的增殖活性；免疫组化定量检测成牙本质细胞早期分化标记物碱性磷酸酶(ALP) 的活性变化。在成牙本质样细胞分化模型中，DPSCs 在接种早期即形成复层生长，部分细胞可形成成牙本质细胞样形态；其微丝骨架发生重组，增殖活性明显降低，碱性磷酸酶活性增高。提示以牙本质磨片为支架构建的成牙本质样细胞分化模型具有促牙髓干细胞定向分化为成牙本质样细胞的能力。牙本质磨片可作为支架材料构建成牙本质样细胞分化模型，促牙髓干细胞向成牙本质样细胞分化。
　　关键词：牙髓干细胞；成牙本质细胞；牙本质磨片；分化；微丝；碱性磷酸酶
　　1．引言
　　龋病，牙髓病，根尖周病可致牙髓活力丧失，保持正常的牙髓活力对于维护牙齿健康具有重要作用。随着细胞生物学的发展，人们开始尝试利用组织工程技术再生牙髓牙本质复合体。1992 年，Tsukamoto 在体外利用牙髓细胞诱导分化出成牙本质样细胞并形成牙本质样的骨矿化基质[1]。随后，有研究表明，BMP-2,4,7、DMP-1,4 等具有促牙髓细胞向成牙本质样细胞分化的作用[2-8]。将DPSCs 与羟基磷灰石(HA) 磷酸三钙（TCP）等支架材料共同移植于裸鼠皮下，可形成供体来源的牙髓牙本质复合体样结构[9-12]。将鼠牙乳头组织块和FGF1,FGF2 和 TGFβ1[13]或aFGF, bFGF, TGF-β1 及IGF-I [14,15] 等生长因子组合培养后，可诱导组织块外层细胞在形态或功能上向成牙本质细胞分化。
　　为了模拟牙髓的生长环境，部分学者以牙本质磨片为支架构建成牙本质细胞分化模型。牙本质磨片的主要成分为HA 和I 型胶原，HA 能形成活跃的离子交换, 促进再矿化；胶原本身所含有的RGD 结构域可以引导细胞特定的识别, 有助于保持细胞的表型及活性，也使牙髓细胞更容易贴壁生长；牙本质磨片中还含有在牙齿发育过程中成牙本质细胞分泌的各种生长因子，包括TGF-β,IGF-1 和FGF-2 及各种各样血管源性生长因子。这些生长因子参与了牙齿发育和组织损伤后修复过程中成牙本质细胞分化的信号启动过程，尤其是转化生长因子超家族中的TGF-β 和骨形成蛋白（BMP）。同时，磨片表面存在天然的牙本质小管，为细胞的生长分化提供了天然的三维立体生长环境，有利于细胞的分化。Magloire H 等[27]在2001 年利用脱矿牙本质中的TGF-β1 和附着有成牙本质细胞的牙本质磨片构建模拟受伤后牙本质细胞的诱导模型，发现TGF-β1 能够通过牙本质小管作用于成牙本质细胞，诱导其I型胶原的mRNA 表达明显增强。这既证实龋病中脱矿牙本质中的生长因子对成牙本质细胞具有诱导作用，另一方面也说明牙本质磨片天然的小管结构在成牙本质样细胞分化模型的构建中可以起到其他人工材料难以媲美的作用。因此推测牙本质磨片能够诱导牙髓细胞向成牙本质细胞分化。另外，2001 年Schmalz G 等[22]将SV40 转染的牛永生化牙髓细胞接种于牙本质磨片，MTT 检测其增殖活力发现与培养皿中培养的细胞相似。扫描电镜观察牙髓细胞成片状贴附，有非单极细胞突起伸入牙本质小管。培养两周后，细胞增殖相互接触呈复层生长，其形态类似上皮样细胞。然而，与该结果不同的是Huang GT 等人[16,17]将酶消化法培养的人牙髓细胞接种于牙本质磨片，培养的第16 天，电镜观察见部分牙髓细胞失去成纤维细胞的形态，胞体呈圆柱形，有单极突起伸入牙本质小管。而细胞在牙本质上几乎没有增殖，细胞数目甚至有所减少。综上所述，牙本质磨片具有诱导牙髓细胞向成牙本质细胞分化的作用。
　　目前，对牙本质磨片在成牙本质细胞分化中作用的研究尚未深入，本实验以牙本质磨片为支架构建成牙本质样细胞体外分化模型，进一步观察牙髓干细胞在该模型中的贴壁生长增殖及分化的过程，评估该模型对成牙本质样细胞分化的有效性。
　　2．材料和方法
　　2.1 牙髓干细胞的培养和组织来源及干细胞标记的鉴定
　　2.1.1 牙髓细胞的培养
　　采用四川大学华西口腔医院临床因阻生或正畸需要拔出的健康完整的牙齿，消毒，劈牙取牙髓，去除根端1/3 牙髓，青、链霉素双抗液浸洗2 次，剪碎。加入0.1％Ⅰ型胶原酶（sigma）3ml，于37℃恒温水浴震荡箱中震荡消化40-60min。终止消化。174g 离心力离心8 分钟。
　　弃去上清液，加入含20％胎牛血清的DMEM 培养基5ml，置于37℃、5%CO2 恒温培养箱（SANYO-MCO17AIC）培养，每4 日换液一次。倒置显微镜观察细胞贴壁、生长、增殖及克隆的形成。待细胞长满瓶底80%用胰酶消化细胞，按1：2 传代。以后待细胞铺满瓶70%时按1:2 或1:3 传代，细胞传至第4 代备用。
　　2.1.2 细胞组织来源鉴定：
　　取生长至第 4 代的牙髓细胞，胰酶(2g/L 胰蛋白酶+ 0.2g/L EDTA)消化后制备成浓度为5×104/ml 的细胞悬液。吸管吸取少量细胞悬液（约6-8 滴）接种于放有玻片的六孔板。待细胞均匀铺于玻片，进行中间丝波形蛋白和角蛋白的免疫组化检测。主要步骤如下：
　　取玻片，PBS 洗涤，4％多聚甲醛固定20min，0.3％H2O2 孵育30 秒，蒸馏水洗3 次，0.1%tritonX-100 处理5min，PBS 洗涤3 次，每次5min，5%牛血清白蛋白封闭10min，弃血清，滴加用小牛血清白蛋白稀释的一抗（抗中间丝波形蛋白抗体为1:50/抗角蛋白抗体为1:200）4℃过夜。PBS 冲洗，滴加二抗（1:100 生物素标记的羊抗小鼠IgG），37℃孵育20min，PBS 冲洗，滴加三抗（1:100 带有过氧化物酶的链霉素亲和素）， 37℃孵育30 min，PBS冲洗，二氨基联苯胺显色，蒸馏水漂洗，苏木精复染2min，二甲苯透明封片，显微镜下观察。
　　2.1.3 牙髓干细胞表面标记物的检测:
　　分别取第4 代和第8 代的牙髓细胞，制备成浓度为5×104/ml 的细胞悬液。吸管分别吸取少量细胞悬液（约6-8 滴）接种于细胞爬片。接种后的第48 小时，待细胞均匀铺于爬片，进行CD45 和CD34 的免疫组化检测。主要步骤同上（其中抗CD34 抗体1：200/抗CD45抗体1：100）。
　　2.2 牙本质磨片的制备
　　取新鲜拔出的智齿数颗，切除冠部釉质及部分牙根。硬组织切片机横切成厚约0.5mm的牙本质磨片。17%EDTA 处理10 分钟，2%柠檬酸处理1 分钟去除玷污层，开放牙本质小管。次氯酸钠溶液浸泡30min 消毒，PBS 溶液反复浸泡2 天，置于无血清培养基中备用，2.5%戊二醛于4℃固定2h，30%-100%酒精梯度脱水各20 分钟，醋酸异戊酯置换15min，真空干燥，喷金，扫描电镜观察处理后牙本质磨片的表面形态。
　　2.3 扫描电镜观察牙髓干细胞在以牙本质磨片为支架的成牙本质样细胞分化模型中的生长变化
　　将生长至第 5 代的牙髓干细胞用胰蛋白酶消化法收集，制备成2×104/ml 细胞悬液。将牙髓干细胞接种于放有牙本质磨片的24 孔板构建成牙本质样细胞分化模型。接种于成牙本质样细胞分化模型中的牙髓干细胞的观察时间点为接种后第1d，2d，4d，8d。实验对照组为以同等密度接种于牙本质磨片上的牙周膜成纤维细胞和接种于玻片上的牙髓干细胞。制作扫描电镜标本的主要步骤：取标本，PBS 冲洗两次，加2.5%戊二醛于4℃冰箱固定2h，30%-100%酒精梯度脱水各20 分钟，醋酸异戊酯置换15min，真空干燥，喷金，扫描电镜观察。
　　2.4 免疫荧光观察分化模型中细胞微丝结构的改变
　　取第 5 代牙髓干细胞，胰蛋白酶消化法消化收集，制备成5×104/ml 细胞悬液，滴入放有牙本质磨片的24 孔板，以接种于24 孔板的牙髓干细胞为实验对照。在接种后的第1d，2d，4d，8d 分别将磨片取出，PBS 冲洗二次， 4%中性多聚甲醛4℃固定15min；PBS ( 10mmol/L, pH7. 4)浸洗3 次，每次5 分钟。用含1ml/L TritonX-100 的PBS 处理细胞5 min, PBS浸洗。加FITC 标记的鬼笔环肽(2mg/L), 于湿盒中恒温37℃避光孵育40 分钟，PBS 浸洗15-20分钟。免疫荧光倒置显微镜观察细胞微丝。对照组处理步骤相同。
　　2.5 MTT 法检测成牙本质样细胞分化模型中细胞的增殖活性
　　取第 4 代牙髓干细胞，用含10%胎牛血清的DMEM 培养基制备成5×104/ml 的细胞悬液，滴加于放有牙本质磨片的24 孔板。实验以用培养基培养在24 孔板中的细胞（培养基）和用矿化液（β-磷酸甘油钠 2.16g/L;地塞米松 3.295μg/L;维生素C 50mg/L;两性霉素B0.3mg/L;碳酸氢钠 2.2g/L; L-谷氨酰胺 0.219g/L;Hepes 2.38g/L;DMEM 培养基 1L）培养在24 孔板中的细胞（矿化液组）为实验对照。在培养的第1d，3d，6d，8d，10d，吸出待测孔的培养基，换入新鲜培养基1ml，并加入2 mg/mlMTT40μl，将细胞放回5% CO2 培养箱中孵育4 小时，再吸去含MTT 的培养基，每孔加入420 μl 二甲基亚砜(DMSO)，震荡混匀，用酶标仪在570nm 波长处读取吸收值。以时间为横坐标，吸光度的平均值为纵坐标，绘制细胞生长曲线。
　　2.6 碱性磷酸酶活性的检测
　　取第 5 代DPSCs 用含10%胎牛血清的DMEM 培养基制备成2×105/ml 细胞悬液，滴加于放有牙本质磨片的6 孔板内；实验以用培养基培养在6 孔板中的细胞（培养基）和用矿化液培养在6 孔板中的细胞（矿化液组）为实验对照。在培养的第1d，3d，6d，8d，10d 分别收集细胞，收集时先用PBS 液洗涤2 次，再用胰蛋白酶消化细胞3-5min，显微镜下观察完全消化下来后，加3ml 培养基混匀后离心（174g，8min），吸弃上清液，加入PBS5ml 重悬细胞，二次离心（174g，8min），吸弃上清液后每个样本加入PBS400ul 混匀后移入1.5mlEP管中存于-20℃冰箱中，待收集完各时间点的细胞后，在检测之前反复冻融细胞3 次，吹打细胞使其破裂。用BCA 试剂盒测定细胞蛋白含量，用柏定碱性磷酸酶试剂盒测定细胞ALP活性，定量测定诱导前后DPSCs 中平均每毫克蛋白中碱性磷酸酶活性的变化。
　　3．实验结果
　　3.1 DPSCs 在成牙本质样细胞分化模型中的形态学研究
　　3.1.1 牙髓细胞的培养
　　I型胶原酶消化组织块法培养的牙髓细胞在接种的3 小时后，即有细胞和组织块贴壁。
　　培养2-3 天，贴壁的组织块内有细胞爬出，细胞呈成纤维细胞样。培养1-2 周，大量的细胞克隆逐渐融合，组织块周围生长的细胞和克隆增殖形成的细胞形态趋于一致，呈成纤维细胞样。
　　3.1.2 牙髓干细胞组织来源的鉴定
　　中间丝是细胞的一种骨架成分, 角蛋白和波形蛋白均为中间丝的一种亚型。角蛋白主要表达于表皮和表皮细胞。波形蛋白主要表达于间充质的成纤维细胞和血管平滑肌细胞及中胚层来源的细胞。对牙髓细胞进行角蛋白免疫组化染色，表达（-），对培养的细胞进行波形蛋白免疫组化染色，表达（+），证明所培养的细胞为间充质来源的细胞。
　　3.1.3 牙髓干细胞表面标记的鉴定结果
　　CD34 是原始的间充质干细胞和造血干细胞的表面标记，CD45 是造血干细胞尤其是白细胞前体细胞的表面标记。在本实验中,分别对第4 代和第8 代牙髓细胞进行CD34 和CD45免疫组化染色。结果发现，第4 代和第8 代牙髓细胞胞中CD34 表达(+)，证明培养的牙髓细胞中含有原始的间充质干细胞,而且在细胞的传代过程中始终有干细胞存在。而第4 代和第8 代牙髓细胞胞中CD45 表达(-)，表明不含有造血干细胞。
　　3.1.4 扫描电镜观察处理过的牙本质磨片
　　经过处理的牙本质磨片在扫描电镜下可见小管口完全开放，小管外观呈浅碟状,直径约5um。管间牙本质形态完好，未见明显脱矿。
　　3.1.5 扫描电镜观察牙髓干细胞在成牙本质样细胞分化模型中的贴壁、生长、增殖过程
　　接种 1d，磨片上可见短梭状细胞贴壁。接种2 天，可见细胞突起伸入牙本质小管,部分细胞形成成牙本质细胞样的单极轴状突起。接种第4 天，磨片上部分区域细胞增殖形成复层生长，细胞表面可见分泌的胞外基质。接种第8 天，细胞密度增加，同样可见复层生长，与第4 天相似。
　　与接种在磨片上的牙髓干细胞相比，同等密度接种在玻片上的牙髓干细胞在1-8 天未见复层生长。扫描电镜观察牙周膜细胞在牙本质磨片上的贴壁、生长、增殖过程，其形态与牙髓干细胞相似，呈扁平状、短梭形或成纤维细胞样但是未见细胞突起伸入牙本质小管，也未见有细胞复层生长。
　　[NextPage]3.1.6 免疫荧光观察细胞微丝骨架
　　免疫荧光观察牙本质磨片和孔板上连续培养的牙髓干细胞的细胞微丝骨架。可见随着时间推移，牙本质磨片上细胞的微丝骨架结构逐渐改变。
　　在细胞接种的第1 天，镜下见牙本质磨片上细胞中的微丝纤细，均匀有序排列于整个胞体内部，微丝呈束状进入细胞的突起；对照组孔板上细胞接种的第1 天，微丝在细胞中的结构及分布与牙本质磨片上的细胞基本相似。
　　在接种的第2天，磨片上细胞的微丝结构变得明显，微丝束明显增粗，镜下可见清晰的微丝分隔，微丝呈纤维条索状沿细胞长轴分布，形成应力纤维。推测此时细胞内微丝结构发生重组，应力纤维生成增加，以适应牙髓干细胞向成牙本质细胞分化过程中形态变化的需要。对照组孔板上的细胞相对而言胞内微丝表达弱于实验组，可见细胞内布满微丝，胞质荧光弱而均匀，边缘胞膜转折处呈明亮的绿线，但是应力纤维不明显。
　　在接种的第4天，细胞微丝逐渐呈密集趋势，对照组细胞内微丝成均匀分散排列，应力纤维较少。在接种的第8天，牙本质磨片上部分区域细胞逐渐密集，细胞内微丝聚集成一至两束应力纤维束，沿细胞长轴并行排列分布。与第4 天相比，应力纤维变得更长更聚集。对照组细胞增殖明显，但是细胞内应力纤维不明显，微丝在整个细胞内部均匀分布，构成成纤维细胞样或梭样外观。
　　3.2 MTT 检测细胞的增殖活性
　　MTT 检测各组细胞的光吸收值（OD 值），结果如表1。磨片组细胞在接种的1-6天缓慢增殖，8-10天增殖不明显，没有明显的对数生长期。相比之下，矿化液组细胞和磨片组的增殖曲线非常相。而培养基组细胞在1-3 天生长缓慢，在接种的第3-6 天进入对数生长期，细胞数量明显增多，在接种的6-10天，细胞增殖减慢，进入生长的平台期 。
　　SPSS 单因素方差分析表明，磨片组细胞的增殖活性明显小于培养基组细胞的增殖活性(p0.05）。
　　3.3 三组细胞碱性磷酸酶活性的检测
　　检测各组细胞碱性磷酸酶活性。在接种的第1 天，三组细胞的ALP 活性十分接近。第3-10 天，矿化液组和磨片组细胞的ALP 活性明显增加。在接种的第10 天矿化液组细胞ALP 活性进入平台期，磨片组细胞的ALP 活性呈下降趋势。相对而言，培养基组的细胞在3-10 天ALP 活性无明显增加。
　　SPSS 单因素方差分析表明，在培养的1-3 天，各组细胞的ALP 活性无显着差异(p>0.05)；但在培养的第6-10 天，磨片组细胞的ALP 活性明显高于培养基组细胞的ALP 活性 (p0.05)。
　　4．讨论
　　研究表明，牙髓干细胞表达CD34，CD44，STRO-1，CD146，3G5 等特异性标记物[9-10,18-19]，在本实验中，分别对第4 代和第8 代牙髓细胞进行CD34 和CD45 免疫组化染色，结果显示， CD34 表达（+），CD45 表达（-），说明在培养的牙髓细胞中有牙髓干细胞存在，并且在细胞传代的过程中，始终有一定数量的牙髓干细胞存在。
　　扫描电镜显示，牙本质磨片上可见诱导后的牙髓干细胞形成细胞突起伸入牙本质小管，但是细胞没有典型的成牙本质细胞形态；同时，牙本质磨片上也可见到偏极化生长的成牙本质样细胞，但是其突起没有伸入小管，这与体内成牙本质细胞也不相同。但与体外培养的永生化成牙本质细胞Mo6-G3 [20]相比,细胞在形态上相似。另外，牙髓干细胞在牙本质磨片上接种仅4 天即形成复层生长，而接种在玻片上的牙髓干细胞在第8 天尚未形成复层生长，王凤明[26]等则对牙髓细胞进行体外连续培养3 周才能形成复层生长，说明牙本质磨片的三维结构能够起到物理信号的诱导作用，具有明显的促进牙髓干细胞形成复层生长的能力。有学者以多孔磷酸三钙为支架接种细胞 [21]，与其相比，接种于磨片上的细胞更密集，更易于产生细胞间的相互作用从而形成复层生长。细胞间的相互作用同样是组织工程信号的一种，对于牙髓牙本质组织工程具有重要的作用。
　　微丝（actin filament），是细胞骨架的一种，在细胞内成束状、网状或纤维状散在分布。非肌细胞的微丝在大多数情况下是一种动态结构,未组装的肌动蛋白与微丝在胞内可以随时组装和解聚以不同的结构形式来适应细胞活动的需要。在接种于牙本质磨片的第1 天，微丝稀疏均匀分布于细胞内，结合扫描电镜观察磨片上生长的牙髓干细胞可知，此时细胞刚好完成贴壁，推测此时牙髓干细胞尚未对磨片的诱导分化作用作出应答。接种的第2 天，细胞微丝增粗，出现明显的应力纤维，此时扫描电镜可观察到磨片上的细胞有成牙本质细胞样突起形成，并有部分细胞的突起伸入牙本质小管，推测此时，牙髓干细胞受到牙本质磨片的诱导，发生形态的变化。为了适应突起形成的需要，微丝的合成迅速增加并向突起方向聚拢推动膜的运动。随着培养时间的进一步增加，生长在磨片上的细胞内微丝逐渐收拢成束，部分细胞可见伸长的应力纤维形成单极突起，沿细胞长轴并行排列，这与Mesgouez C[20]等用免疫荧光对永生化成牙本质细胞MO6-G3 的微丝结构进行研究时结果一致。而对照组细胞则无明显的应力纤维束形成，仅显示为均匀散在分布。与Wang FM 等[21]接种在多孔磷酸钙盐材料上的细胞微丝骨架相比，牙本质磨片上细胞中的应力纤维更明显。
　　关于牙髓干细胞在牙本质磨片上的增殖活性，有学者[16,17]认为牙髓干细胞在磨片上几乎不增殖。也有人[22]认为细胞在牙本质磨片上的增殖率与在培养板上没有差别。然而，尚没有相关实验对此作出进一步检测。在本实验中，加入矿化液后，牙髓干细胞的增殖活性明显减弱，说明在矿化液的诱导下，牙髓干细胞出现向成牙本质细胞分化。而牙髓干细胞在磨片上的增殖率明显低于接种24 孔板的牙髓干细胞，与接种在矿化液中的细胞相似，推测牙本质磨片能够诱导牙髓干细胞向成牙本质细胞分化，从而使细胞增殖的能力减弱。
　　为了进一步证实牙本质磨片具有诱导牙髓干细胞向成牙本质细胞分化的能力，我们检测了接种在牙本质磨片上的牙髓干细胞的ALP 的活性。ALP 是反映牙髓干细胞生物学特性的关键酶，是牙髓干细胞向成牙本质细胞分化的前提，在牙齿的矿化过程中具有重要的作用。ALP 活性增强，被认为是牙髓干细胞向成牙本质细胞分化和牙本质形成的早期标志[22-25]。因此，我们采用ALP 作为判断牙髓干细胞是否向成牙本质样细胞分化的指标。本实验中，对三种不同培养条件下的牙髓干细胞进行ALP 活性检测，结果表明在培养基组的牙髓干细胞中ALP 活性轻度表达，随着培养时间的增长，ALP 的活性会轻度增高。而培养在成牙本质样细胞分化模型中的牙髓干细胞的ALP 活性增加明显，与培养在矿化液中的牙髓干细胞的ALP 活性无统计学差异。这说明以牙本质磨片为支架的成牙本质样细胞分化模型与矿化液在诱导细胞矿化上具有相似的作用，能够诱导牙髓干细胞向成牙本质样细胞分化。这一结论符合MTT 的检测结果，同时也支持了实验一中关于成牙本质样细胞分化模型促牙髓干细胞向成牙本质样细胞分化的推论。
　　牙本质磨片中含有发育时分泌在牙本质中的TGFβs，IGF,BMPs 等各种生长因子和难溶性胞外基质，这些生长因子和基质能够在一定的条件下被释放而对细胞产生诱导作用，由于本实验中采用杀菌效能强大的次氯酸钠对牙本质磨片进行了30 分钟的预处理，所以磨片本身具有的生长因子已基本失去活性，因此我们认为牙髓干细胞定向分化为成牙本质细胞主要源于牙本质磨片的三维物理环境，至于牙本质磨片中生长因子及胞外基质对细胞分化的影响尚需进一步研究。
　　5．总结
　　牙本质磨片能够从形态和功能两方面对牙髓干细胞的分化提供重要的诱导作用，使牙髓干细胞表现出成牙本质细胞的形态学特征，增殖活性减弱，微丝重组，碱性磷酸酶活性增强。以牙髓干细胞为种子细胞，以牙本质磨片为支架构建的成牙本质样细胞分化模型为研究成牙本质细胞的分化机制和牙髓牙本质复合体的再生提供了新的思路和选择。
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