血链球菌部分基因克隆及与nif基因同源序列初探

P>　　摘要 目的:分析血链球菌染色体DNA片段序列,探讨血链球菌遗传生物学特性。方法:采用TA克隆技术将此片段转化克隆并进行碱基序列测定,通过GenBank进行同源分析。结果:血链球菌ATCC10556 DNA片段含有与固氮菌高度同源的nifS、nifU基因,同源分值为114点(bits)。结论:国内外首次报道血链球菌DNA片段含有nifS、nifU部分基因。

　　血链球菌属口腔固有菌群,近年牙周病微生物学研究显示血链球菌与大多数牙周可疑致病菌部位检出率之间是一种负相关关系。体外实验证实血链球菌对大多数牙周可疑致病菌均有很强的拮抗作用,拮抗机理一方面通过产生细菌素样物质,一方面通过过氧化氢的释放。细菌学检测也显示某些顽固性牙周炎口腔缺乏原藉血链球菌。因此,深入研究血链球菌生物学特性,特别是遗传学行为将为利用血链球菌及其产物防治牙周病提供有效的实验数据,也将对口腔微生物学的深入研究具重要意义。

1 材料和方法
1.1 PCR扩增及产物纯化
　　血链球菌(Streptococcus sanguis,S.s)ATCC10556染色体DNA为模板,引物为S1-S2即5’GAGGTCCACA 3′,5’CCTCTGACTG 3’。用PCR方法扩增特异基因片段。50 μl体积PCR反应体系为94℃ 1分钟、45℃ 1分钟、72℃ 1分钟,最后72℃延伸7分钟,35个循环。扩增产物经8%聚丙烯酰胺检测后,用1.5%的低熔点琼脂糖回收特异DNA片段,回收的DNA用WizardTMPCR Preps DNA纯化试剂盒进行纯化,纯化产物经紫外分光光度计进行定量。
1.2 PCR产物的克隆
　　用TA克隆系统(Eukaryotic TA cloning system, Invitrogen)通过载体连接将上述PCR产物直接克隆到PCRTM3真核表达质粒上。
1.3 质粒提取
　　采用质粒纯化试剂盒(plasmid mini kit)快速提取质粒。
1.4 筛选阳性克隆
　　采用限制性内切酶分析方法,用EcoRⅠ消化重组质粒,37℃消化过夜后经12%聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定插入子的片段大小。
1.5 DNA片段碱基序列测定
　　采用荧光素引物标记法(Dye-Primer),使用荧光素标记的通用引物T7。用ABI PRISM 310全自动遗传分析仪对带有原PCR产物的重组体PCR3-S.sr进行测序。
1.6 蛋白氨基酸同源序列分析
　　将已知碱基序列转换为氨基酸序列,进入GenBank系统进行蛋白氨基酸同源序列分析。

2 结 果
2.1 血链球菌PCR扩增及产物纯化结果
　　PCR扩增合成的DNA片段长度约为800碱基对(base pair,bp)清晰单一条带,经过低熔点琼脂糖回收及纯化符合克隆条件(图1)。

图1　血链球菌PCR扩增及800bp片段纯化结果
A：φ174 DNA/Has Ⅲ markers
B:ATCC10556 DNA琼脂糖回收后再次PCR扩增

2.2 血链球菌DNA片段阳性克隆鉴定
　　PCRTM3有两个EcoRI酶切位点,重组质粒PCR3-DNA S.sr经过EcoRI消化后预计得到816 bp的含DNA S.sr基因的片段。电泳结果显示所选择的质粒与预期相符,克隆成功(图2)。

图2　重组质粒EcoRI酶切结果　A、B的酶切片段长度与预期基本符合

2.3 血链球菌克隆基因序列分析结果
　　根据限制性内切酶分析结果,测序后所读出的序列应为载体序列→S1-S2引物序列→S.sr DNA碱基序列→载体序列,测序结果与预期完全相符。
2.4 血链球菌克隆基因蛋白同源序列分析
　　通过GenBank的Database similarity search检测,显示氨基酸序列的6个阅读框架与nifS,nifU基因具有高度同源性,与已知16个微生物nifS和nifU基因含有部分同源序列,同源分值为114点,符合同源标准(表1)。

表1 ATCC10556 nif基因同源序列分析

3 讨 论
3.1 血链球菌部分DNA片段基因克隆与表达分析
　　本实验采用的TA克隆技术原理是Taq DNA聚合酶具有一种非模板依赖性的活性,能在双链DNA分子的3’末端添加一个A。因此,PCR产物的3’末端均突出一个A,真核TA克隆系统正是利用Taq DNA聚合酶这种特性设计了一种3’末端突出单个T的能在哺乳动物细胞直接表达的线性质粒PCRTM3。根据T-A互补原理,PCR产物可以直接连结到真核表达载体上［1,2］。本文选择较短一对引物即10个碱基,目的在于寻找口腔链球菌DNA多态位点的差异,结果显示ATCC 10556在PCR扩增产物800 bp左右有一DNA条带,扩增结果稳定,显示较强的特异性,经过纯化仍可扩增说明特异及纯化度较高。通过核酸序列分析,前55个碱基为已知的载体序列,55位至65位为原引物序列,表明运用真核TA克隆表达PCR产物获得成功,并获得了部分血链球菌的遗传基因。
3.2 血链球菌nifS、nifU基因同源序列分析
　　nif基因(nitrogen fixed gene)被发现在固氮菌中,属于固氮酶基因［3～5］。Walter Arnold于1988年首次报道克氏肺炎杆菌nif基因全序列为24206个碱基的DNA片段,其中nifS和nifU是固氮酶的成熟基因［6］。血链球菌ATCC 10556的DNA片段与16种微生物的nif基因进行同源序列分析,显示具有较高的同源性。在血链球菌DNA片段克隆表达的氨基酸序列中,+2阅读框架主要含有nifU基因同源序列,+3阅读框架主要含有nifS同源基因序列。
3.3 血链球菌nif基因的生理功能推测
　　对于固氮菌的生理功能研究提示,此类细菌具有自生固氮活性［7］。通过氧呼吸和吸氢酶的作用达到避氧固氮,同时在固氮中释放氢气,其中钼铁蛋白和铁蛋白复合物-固氮酶起催化调节作用［8］。
　　血链球菌是口腔链球菌中释放过氧化氢的微生物。血链球菌主要通过释放过氧化氢和细菌素达到防止外来菌侵入口腔的作用。什么机制导致血链球菌能够释放过氧化氢而其它细菌如变形链球菌、唾液链球菌无此功能一直未有明确答案。血链球菌是口腔早期定植菌,除了血链球菌具有较强粘附牙面的作用,导致血链球菌长期存留于口腔可能与其它影响因素有关。血链球菌不属于固氮菌,却含有nifS、nifU基因,能否推断血链球菌具有类固氮样作用,在血链球菌营养代谢中显示比其它细菌更具有优势而存在于口腔。通过对固氮菌在固氮过程中释放氢气提示血链球菌释放过氧化氢的机理可能与nif基因表达相关,因此深入研究nif基因表达与血链球菌产生过氧化氢机理相关性研究具有重要意义。

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